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毕赤酵母电转化问题求助
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我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢 1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用 2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul 3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯 4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板 但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教 |
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 酵母表达纯化一站式解决！ | 【分子生物】EPI帖 |
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送鲜花一朵 
3楼2012-09-16 09:52:06
5楼2012-09-17 09:09:49
|
谢谢，我初做看大家是这么说的 我请问一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI线性化的，但不知道是否有问题，涂到MD板上3-4天了，长得跟针尖一样很小很小，不用力看都看不见，并且没有涂开的部分是一片一片的，连单个小菌落也没有，我都怀疑是不是克隆子，但应该是酵母，因为是酵母的味道。 涂板的时候取200ul涂板；还有两个是把转化后的全部菌1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板 现在实在没有办法往下进展，因为我重复一次还是这样的，今天我把长出来的那些东西用YPD培养基冲洗下来分别涂了不同浓度的G418的YPD板和空白的YPD板，以及MD板，想看看能不能长出来 希望您能给我分析一下，往下怎么做？ 谢谢 |
8楼2012-09-17 17:00:34
10楼2012-09-18 12:45:15
11楼2012-09-18 12:52:33
13楼2012-09-18 14:27:48
14楼2012-09-18 14:33:18
16楼2012-09-19 09:14:14
17楼2012-09-19 10:12:47