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pidou213

木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】毕赤酵母表达

本人在电转整合目的基因至酵母中后,然后提取酵母基因组,并PCR扩增,然后测序鉴定,发现序列没有任何问题。但是在做Western的时候却做不出条带,请问有什么可能?
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dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-02-18 10:48:14
ORF是否正确。
3楼2011-01-22 10:19:17
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-01-22 10:19:17:
ORF是否正确。

绝对正确
4楼2011-01-22 11:01:38
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cxl_yll

木虫 (正式写手)


pidou213(金币+1): 元宵节快乐 2011-02-17 21:38:43
pidou213(金币+1): 2011-08-06 14:06:21
你用的什么载体啊?启动子对不?实在不行做个RT-PCR看看能出来东西不?
5楼2011-02-17 13:36:06
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by cxl_yll at 2011-02-17 13:36:06:
你用的什么载体啊?启动子对不?实在不行做个RT-PCR看看能出来东西不?

可能是因为挑取的菌斑太少了,呵呵 谢谢啊
6楼2011-02-17 21:38:30
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)


pidou213(金币+1): 2011-08-06 14:06:17
没有表达
7楼2011-02-18 09:57:35
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2011-02-18 09:57:35:
没有表达

你觉得为什么没表达呢?
8楼2011-02-18 12:04:31
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rioarsenal

金虫 (正式写手)


pidou213(金币+1): 2011-08-06 14:06:39
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-22 00:31:28:
本人在电转整合目的基因至酵母中后,然后提取酵母基因组,并PCR扩增,然后测序鉴定,发现序列没有任何问题。但是在做Western的时候却做不出条带,请问有什么可能?

楼主检查载体了么,启动子有没有问题啊?

另外表达的蛋白是胞内还是胞外?
9楼2011-02-18 14:43:58
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-02-18 06:43:58:
楼主检查载体了么,启动子有没有问题啊?

另外表达的蛋白是胞内还是胞外?

启动子的意思是??

我表达的是胞内
10楼2011-02-19 01:27:06
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-02-18 04:04:31:
你觉得为什么没表达呢?

没有表达的原因可能很多吧,载体(启动子)没有选好,密码子偏爱性问题等等
11楼2011-02-19 14:09:08
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jingxiu999

新虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
你好,我电转化后怎么老是筛选不到重组子呢?你pcr的模板用的是提取的基因组吗?还是用的菌斑
12楼2011-06-23 11:42:16
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-02-18 14:43:58:
楼主检查载体了么,启动子有没有问题啊?

另外表达的蛋白是胞内还是胞外?

胞内表达的话 破碎的时候用涡旋仪可以吗?2500rpm
13楼2011-06-23 12:29:42
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by jingxiu999 at 2011-06-23 11:42:16:
你好,我电转化后怎么老是筛选不到重组子呢?你pcr的模板用的是提取的基因组吗?还是用的菌斑

我用的是提取DNA然后PCR的方法
14楼2011-06-23 12:30:10
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rioarsenal

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by pidou213 at 2011-02-19 01:27:06:
启动子的意思是??

我表达的是胞内

启动子,基因表达必须的啊。没它如何转录。另外,目的基因有没有内含子序列啊,在酵母里能否正确剪切?细胞内的蛋白要破细胞,是否操作过程中有损失呢?为何不改成分泌蛋白呢?
15楼2011-08-11 06:26:19
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hkfgwww

银虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by pidou213 at 2011-02-19 01:27:06:
启动子的意思是??

我表达的是胞内

不知道启动子?启动子错误的话DNA不会转录的,更被说表达了。
16楼2011-08-11 15:28:30
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by pidou213 at 2011-01-22 00:31:28:
本人在电转整合目的基因至酵母中后,然后提取酵母基因组,并PCR扩增,然后测序鉴定,发现序列没有任何问题。但是在做Western的时候却做不出条带,请问有什么可能?

如果直接电泳能看到带的话,说明你的wesrern有问题
17楼2011-08-18 00:07:25
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tcguobing

银虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
表达的蛋白会不会是膜结合蛋白?或者没有表达?能都做个功能验证啥的?
18楼2011-08-18 18:53:43
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
18楼: Originally posted by tcguobing at 2011-08-18 18:53:43:
表达的蛋白会不会是膜结合蛋白?或者没有表达?能都做个功能验证啥的?

没明白什么意思
19楼2011-08-19 00:09:55
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tcguobing

银虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by pidou213 at 2011-08-19 00:09:55:
没明白什么意思

除了做western没有其他方法可以验证目的基因表达了么?之前也碰到过一种情况,表达的蛋白是结合到细胞膜上的话,做western是做不出条带的。因为目前为止还没有很好的分离膜结合蛋白的方法。个人认为,你可以先预测一下你要表达基因的跨膜结构。个人见解,仅供参考
20楼2011-08-19 09:34:23
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简单回复
huigoo2楼
2011-01-22 04:33   回复  
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