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belinda227

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】毕赤酵母表达无活性 已有6人参与

我的蛋白是个同源四聚体,每个亚基的分子量为57KD,是胞内酶,AT含量很高,达到60%。选取亚基的片段与pPICZαA构建了重组表达载体,电转化SMD-1168宿主菌。前期经过抗生素梯度抗性筛选,并经PCR验证正确。根据操作手册,用甲醇诱导其表达,在上清液中一直无法测到酶活。请各位毕赤酵母表达高手指点迷津,谢谢了!
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 10:52:41
酵母是真核生物,分泌表达产物一般经过糖基化修饰的,有可能影响活性的。
2楼2010-11-22 10:01:42
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-22 11:01:21
1 胞内多聚体酶能否分泌是个问题
2 AT含量过高也是个问题
3楼2010-11-22 10:55:58
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belinda227

木虫 (小有名气)

请问还需要跑SDS-PAGE检测吗
4楼2010-11-22 13:55:41
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2585165

金虫 (正式写手)

★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢回复 2010-11-22 16:55:18
你可以同时看看菌体是否有活性。不一定就会分泌出去。
哎呀呀,别老说我丑,比起小时候,我这还真算是漂亮了!
5楼2010-11-22 15:45:48
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 16:55:02
请问你上清经过浓缩了吗?测蛋白含量了吗?会不会是因为蛋白含量太低了?
Thank-you,so-blue.
6楼2010-11-22 15:46:06
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belinda227

木虫 (小有名气)

了解了,谢谢各位了
7楼2010-11-22 16:38:53
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easthero

木虫 (小有名气)

★ ★
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-24 12:24:23
你的亚基是在四聚体的情况下才有活性,还是单个亚基就有活性。另外上清中表达的蛋白量一般都偏低,检测活性是否需要一定的反应条件,而上清中的培养基成分是否对它有影响,有否用培养基加入酶检测活性作为对照。
另外表达后的产物是否经纯化后做SDS-PAGE鉴定大小 ,有抗体的话还可做western-Blot进行确证。
8楼2010-11-23 14:07:54
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belinda227

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by easthero at 2010-11-23 14:07:54:
你的亚基是在四聚体的情况下才有活性,还是单个亚基就有活性。另外上清中表达的蛋白量一般都偏低,检测活性是否需要一定的反应条件,而上清中的培养基成分是否对它有影响,有否用培养基加入酶检测活性作为对照。
...

是在四聚体的状态才有活性,我直接去上清液跑SDS-PAGE, 结果用考马斯亮蓝染色物条带,应该是上清中的蛋白含量太低了,我用丙酮沉淀后准备再跑一次
9楼2010-11-24 08:44:37
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