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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】毕赤酵母表达无活性
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belinda227

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】毕赤酵母表达无活性 已有6人参与

我的蛋白是个同源四聚体，每个亚基的分子量为57KD，是胞内酶，AT含量很高，达到60%。选取亚基的片段与pPICZαA构建了重组表达载体，电转化SMD-1168宿主菌。前期经过抗生素梯度抗性筛选，并经PCR验证正确。根据操作手册，用甲醇诱导其表达，在上清液中一直无法测到酶活。请各位毕赤酵母表达高手指点迷津，谢谢了！
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1楼 2010-11-22 09:54:02
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 10:52:41
酵母是真核生物，分泌表达产物一般经过糖基化修饰的，有可能影响活性的。
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2楼2010-11-22 10:01:42
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-22 11:01:21
1 胞内多聚体酶能否分泌是个问题
2 AT含量过高也是个问题
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3楼2010-11-22 10:55:58
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belinda227

木虫 (小有名气)
请问还需要跑SDS-PAGE检测吗
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4楼2010-11-22 13:55:41
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2585165

金虫 (正式写手)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢回复 2010-11-22 16:55:18
你可以同时看看菌体是否有活性。不一定就会分泌出去。
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哎呀呀，别老说我丑，比起小时候，我这还真算是漂亮了！
5楼2010-11-22 15:45:48
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 16:55:02
请问你上清经过浓缩了吗？测蛋白含量了吗？会不会是因为蛋白含量太低了？
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Thank-you，so-blue.
6楼2010-11-22 15:46:06
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belinda227

木虫 (小有名气)
了解了，谢谢各位了
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7楼2010-11-22 16:38:53
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easthero

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-24 12:24:23
你的亚基是在四聚体的情况下才有活性，还是单个亚基就有活性。另外上清中表达的蛋白量一般都偏低，检测活性是否需要一定的反应条件，而上清中的培养基成分是否对它有影响，有否用培养基加入酶检测活性作为对照。
另外表达后的产物是否经纯化后做SDS-PAGE鉴定大小 ，有抗体的话还可做western-Blot进行确证。
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8楼2010-11-23 14:07:54
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belinda227

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by easthero at 2010-11-23 14:07:54:
你的亚基是在四聚体的情况下才有活性，还是单个亚基就有活性。另外上清中表达的蛋白量一般都偏低，检测活性是否需要一定的反应条件，而上清中的培养基成分是否对它有影响，有否用培养基加入酶检测活性作为对照。
...

是在四聚体的状态才有活性，我直接去上清液跑SDS-PAGE， 结果用考马斯亮蓝染色物条带，应该是上清中的蛋白含量太低了，我用丙酮沉淀后准备再跑一次
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9楼2010-11-24 08:44:37
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