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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】毕赤酵母表达
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pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】毕赤酵母表达

本人在电转整合目的基因至酵母中后，然后提取酵母基因组，并PCR扩增，然后测序鉴定，发现序列没有任何问题。但是在做Western的时候却做不出条带，请问有什么可能？
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1楼 2011-01-22 00:31:28
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-02-18 10:48:14
ORF是否正确。
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3楼2011-01-22 10:19:17
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-01-22 10:19:17:
ORF是否正确。

绝对正确
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4楼2011-01-22 11:01:38
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cxl_yll

木虫 (正式写手)
pidou213(金币+1): 元宵节快乐 2011-02-17 21:38:43
pidou213(金币+1): 2011-08-06 14:06:21
你用的什么载体啊？启动子对不？实在不行做个RT-PCR看看能出来东西不？
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5楼2011-02-17 13:36:06
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by cxl_yll at 2011-02-17 13:36:06:
你用的什么载体啊？启动子对不？实在不行做个RT-PCR看看能出来东西不？

可能是因为挑取的菌斑太少了，呵呵 谢谢啊
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6楼2011-02-17 21:38:30
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)
pidou213(金币+1): 2011-08-06 14:06:17
没有表达
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7楼2011-02-18 09:57:35
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2011-02-18 09:57:35:
没有表达

你觉得为什么没表达呢？
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8楼2011-02-18 12:04:31
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
pidou213(金币+1): 2011-08-06 14:06:39
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-22 00:31:28:
本人在电转整合目的基因至酵母中后，然后提取酵母基因组，并PCR扩增，然后测序鉴定，发现序列没有任何问题。但是在做Western的时候却做不出条带，请问有什么可能？

楼主检查载体了么，启动子有没有问题啊？

另外表达的蛋白是胞内还是胞外？
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9楼2011-02-18 14:43:58
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-02-18 06:43:58:
楼主检查载体了么，启动子有没有问题啊？

另外表达的蛋白是胞内还是胞外？

启动子的意思是？？

我表达的是胞内
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10楼2011-02-19 01:27:06
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旋木晴晴

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-02-18 04:04:31:
你觉得为什么没表达呢？

没有表达的原因可能很多吧，载体（启动子）没有选好，密码子偏爱性问题等等
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11楼2011-02-19 14:09:08
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jingxiu999

新虫 (初入文坛)
★
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你好，我电转化后怎么老是筛选不到重组子呢？你pcr的模板用的是提取的基因组吗？还是用的菌斑
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12楼2011-06-23 11:42:16
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2011-02-18 14:43:58:
楼主检查载体了么，启动子有没有问题啊？

另外表达的蛋白是胞内还是胞外？

胞内表达的话 破碎的时候用涡旋仪可以吗？2500rpm
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13楼2011-06-23 12:29:42
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jingxiu999 at 2011-06-23 11:42:16:
你好，我电转化后怎么老是筛选不到重组子呢？你pcr的模板用的是提取的基因组吗？还是用的菌斑

我用的是提取DNA然后PCR的方法
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14楼2011-06-23 12:30:10
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
10楼: Originally posted by pidou213 at 2011-02-19 01:27:06:
启动子的意思是？？

我表达的是胞内

启动子，基因表达必须的啊。没它如何转录。另外，目的基因有没有内含子序列啊，在酵母里能否正确剪切？细胞内的蛋白要破细胞，是否操作过程中有损失呢？为何不改成分泌蛋白呢？
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15楼2011-08-11 06:26:19
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hkfgwww

银虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by pidou213 at 2011-02-19 01:27:06:
启动子的意思是？？

我表达的是胞内

不知道启动子？启动子错误的话DNA不会转录的，更被说表达了。
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16楼2011-08-11 15:28:30
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
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1楼: Originally posted by pidou213 at 2011-01-22 00:31:28:
本人在电转整合目的基因至酵母中后，然后提取酵母基因组，并PCR扩增，然后测序鉴定，发现序列没有任何问题。但是在做Western的时候却做不出条带，请问有什么可能？

如果直接电泳能看到带的话，说明你的wesrern有问题
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17楼2011-08-18 00:07:25
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tcguobing

银虫 (初入文坛)
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表达的蛋白会不会是膜结合蛋白？或者没有表达？能都做个功能验证啥的？
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18楼2011-08-18 18:53:43
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pidou213

木虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by tcguobing at 2011-08-18 18:53:43:
表达的蛋白会不会是膜结合蛋白？或者没有表达？能都做个功能验证啥的？

没明白什么意思
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19楼2011-08-19 00:09:55
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tcguobing

银虫 (初入文坛)
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19楼: Originally posted by pidou213 at 2011-08-19 00:09:55:
没明白什么意思

除了做western没有其他方法可以验证目的基因表达了么？之前也碰到过一种情况，表达的蛋白是结合到细胞膜上的话，做western是做不出条带的。因为目前为止还没有很好的分离膜结合蛋白的方法。个人认为，你可以先预测一下你要表达基因的跨膜结构。个人见解，仅供参考
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20楼2011-08-19 09:34:23
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huigoo2楼
2011-01-22 04:33   回复  
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