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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转化问题求助
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-09-15 10:39:27
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-18 09:22:21
线性化完了先跑电泳检测下是否线性化完全和大小是否正确。
涂板后3-4天长出来比较少见，但也正常。
涂板时要涂到都被培养基吸收才行，所以出现一小片白的也是正常的。
重新做批感受态再转吧。...

好的，我再转吧。你能不能给我详细写一下你做感受态及电转化的操作的具体步骤？我真怕是操作的问题，谢谢了！
还有转化的参数是什么？谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
10楼2012-09-18 12:45:15
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xiaodao1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5 2012-09-16 09:52:13
你第一步重悬用的山梨醇用量太多，而且感受态放-80度后转化率会降低，最好现做现用。
还有可能会3天才出来转化子啊。
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475502411
2楼2012-09-15 20:44:10
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaodao1 at 2012-09-15 20:44:10
你第一步重悬用的山梨醇用量太多，而且感受态放-80度后转化率会降低，最好现做现用。
还有可能会3天才出来转化子啊。

这样啊，那以后我就现做现用
那第一步的山梨醇重悬用多少比较合适啊？
我的线性化有问题吗？
谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2012-09-16 09:52:06
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xiaodao1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-16 09:52:06
这样啊，那以后我就现做现用
那第一步的山梨醇重悬用多少比较合适啊？
我的线性化有问题吗？
谢谢...

我线性化后一般直接做了胶回收，用尽量少的无菌水洗脱，让质粒尽量弄。另外加山梨醇重悬的时候，没有具体的量，一般100mL的菌液做的感受态细胞，最后我是加200-400uL重悬，而且根据具体情况，尽量少加，让感受态细胞尽量越浓越好。
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475502411
4楼2012-09-16 22:51:59
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