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475502411

铜虫 (著名写手)

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[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2012-09-15 10:39:27

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铜虫 (著名写手)

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引用回帖:

12楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-18 13:27:19
我在资源帖中发过感受态制备过程和转化。过程没有那么严格，步骤也都也的比较清楚。现做现用的要求要严格些。长期保存的主要是BEDS和DTT处理，没有什么特殊之处。我这说要写好多，你下载看看吧，更简单。...

谢谢，好的，这是我的操作步骤，你看有问题吗？
感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取100ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用300微升1M山梨醇重悬80微升分装

这是我听了朋友们的建议改了一下，准备后天做
你帮我看看还有问题吗？

谢谢