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475502411

铜虫 (著名写手)

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[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2012-09-15 10:39:27

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reallpf

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

17楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-19 10:12:47
您好，我还想问一下我要是现做感受态立即用，是不是可以用山梨醇的方法，因为我看了您给我发的那个连接，好几个试剂我们实验室都是没有的，买的话我问了要等到下周，我想这周做一次？
还有，线性化完不用去磷酸化 ...

现做现用的感受态方法http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4734449。如果着急做可以用你自己的方法，转化量加大点看有没有结果。
线性化完不用去磷酸化，直接cycle-pure回收（DNA片段直接回收试剂盒），胶回收损失太大。如果没有cycle-pure试剂盒，必须用胶回收，就切的质粒多一点（5-10ug），但要酶切完全（电泳检测），胶回收做的好，回收率可以达到70%左右。