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铜虫 (著名写手)

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专业: 认知心理学

[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2012-09-15 10:39:27

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foxcl

铁虫 (正式写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

1、OD600没有问题，初始在1.2-1.6都可以。剩下的做感受态也没啥问题。
　　不过最好现用现配。-80保存也是可以的。
２、线性化→ＤＮＡ清洁试剂盒回收（最后一步用６５度纯水洗脱，要是用ＴＥ的话，电转体系中盐离子浓度高，电击杯会爆火花的）
３、电转化你用什么参数？我们用1500v，25uF，200欧姆
4、转化完要加500－700山梨醇复苏，吸到EP管中30度复苏2－3h。然后涂MD板或G418板。
5、延长培养时间。我们的就是将近3天才长出来。

祝好。