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475502411

铜虫 (著名写手)

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[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教

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1楼 2012-09-15 10:39:27

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

reallpf

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

8楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-17 17:00:34
谢谢，我初做看大家是这么说的
我请问一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI线性化的，但不知道是否有问题，涂到MD板上3-4天了，长得跟针尖一样很小很小，不用力看都看不见，并且没有涂开的部分是一片一片的，连单个 ...

线性化完了先跑电泳检测下是否线性化完全和大小是否正确。
涂板后3-4天长出来比较少见，但也正常。
涂板时要涂到都被培养基吸收才行，所以出现一小片白的也是正常的。
重新做批感受态再转吧。