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475502411

铜虫 (著名写手)

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[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教

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1楼 2012-09-15 10:39:27

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reallpf

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置顶 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 热情啊 2012-09-17 17:25:15

你的感受态等于是只用山梨醇处理了，这样效果不好。我在资源帖上分享了毕赤酵母现做现用感受态和长期保存感受态的制备方法。转化效率都非常好。建议你去看看然后试试。

你的菌OD值才1.4，只离心了25mL，菌量太少了，感受态不要做的菌量太低。

另外，质粒线性化后不用去磷酸化，都是线性化产物直接转毕赤酵母的。

电转后要加500--1000uL的冰预冷1 M山梨醇后再复苏，如果涂MD板是不用复苏的，涂抗性板需要摇床复苏1 h后再涂板。

涂板200uL太少了点，本来菌少转化效率也低，就要多涂。

仅为交流。