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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转化问题求助
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 毕赤酵母电转化问题求助

我的电转步骤如下，但不知道是否有问题，涂到MD板上两天了，也没有长出来，请各位大侠帮我看看，谢谢
1. 感受态的制备：过夜培养的OD =1.4，取25ml离心---用25ml冰浴灭菌水重悬离心---用12.5ml冰浴灭菌水重悬离心----用2ml冰浴1M山梨醇重悬离心-------用500微升1M山梨醇重悬80微升分装----负80备用
2.质粒线性化：测序正确的质粒用SacI每期峨眉线性化------DNA直接回收试剂盒回收------用BAP去磷酸化试剂盒去磷酸化-------跑胶回收，用25微升TE洗脱，浓度大约为30ng/ul
3.电转化：用伯乐的电转移，按照仪器自身的毕赤酵母的电转参数进行，用的0.2的电转杯
4.电转后30℃静置1-2h，取200ul涂板；还有两个是把电转液1500g离心30s弃上清，沉淀混匀涂板

但两天了都没有东西长出来，不知道是不是哪儿出问题了，请指教
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-09-15 10:39:27
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jane晨宝儿

铜虫 (初入文坛)
我觉得有可能是你转化用的质粒浓度太低，之前我做的时候也是没有转化出来，后来在线性化这一步，我做了大体系，取一小部分跑胶，确定切开之后，用剩下的直接电转，没有进行回收这一步，因为我觉得回收后，浓度太低，不利于转化。反正我就是这样转化成功了，希望能对你有帮助~~
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26楼2012-12-09 22:49:55
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xiaodao1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5 2012-09-16 09:52:13
你第一步重悬用的山梨醇用量太多，而且感受态放-80度后转化率会降低，最好现做现用。
还有可能会3天才出来转化子啊。
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475502411
2楼2012-09-15 20:44:10
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475502411

铜虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaodao1 at 2012-09-15 20:44:10
你第一步重悬用的山梨醇用量太多，而且感受态放-80度后转化率会降低，最好现做现用。
还有可能会3天才出来转化子啊。

这样啊，那以后我就现做现用
那第一步的山梨醇重悬用多少比较合适啊？
我的线性化有问题吗？
谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2012-09-16 09:52:06
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xiaodao1

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2012-09-16 09:52:06
这样啊，那以后我就现做现用
那第一步的山梨醇重悬用多少比较合适啊？
我的线性化有问题吗？
谢谢...

我线性化后一般直接做了胶回收，用尽量少的无菌水洗脱，让质粒尽量弄。另外加山梨醇重悬的时候，没有具体的量，一般100mL的菌液做的感受态细胞，最后我是加200-400uL重悬，而且根据具体情况，尽量少加，让感受态细胞尽量越浓越好。
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475502411
4楼2012-09-16 22:51:59
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