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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酵母X33电转的问题 已有5人参与

最近做了几次电转酵母,都不成功。第一次是才开始做,第一次做的感受态好像污染了,电转一天后就长出类似于细菌的东东,接着做了一次感受态,电转一天后长了一颗类似酵母的菌,检测为阴性(按常规方法跑的菌落PCR,有很淡的目的条带,点样孔附近还有很亮的条带,估计是阴性,不知道这步是不是有问题)。前两次的感受态都好像培养过了一点,第三次算是正常的,再按前两次的条件转,3天了什么都没长。我的电转条件是2000v,3~5ms,80ul感受态加了10ul线性化后的质粒,郁闷中,请教实验室同门的同时也请虫友指教一下,谢谢!

[ Last edited by 王雨云 on 2010-4-29 at 09:27 ]
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erosionsdd

禁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
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2楼2010-04-29 21:54:07
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王雨云

金虫 (小有名气)

不是新的,不过那是我第一次做感受态,可能操作中有什么问题吧。现在做了几次,没有这个问题了,但是就是长不出来,不长菌的原因太多了,实在是不知道从何下手,只有自己慢慢摸索了,不过还是欢迎大家把自己遇到的或者看到过的原因来说一说,可以多方面参考一下。
3楼2010-04-30 08:11:27
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沙中清泉

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
优化一下电转条件,还有质粒浓度
4楼2010-04-30 08:28:31
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liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼上的几位大侠,你们有没有具体的方法参照的呢,能发一下么,谢谢分享~
5楼2010-04-30 10:15:53
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王雨云

金虫 (小有名气)

貌似我忘了去除信号肽了,实验室有人说基因没切除信号肽可以直接切表达质粒上的,不晓得这样行不行得通,或者影响大不大?
6楼2010-04-30 16:16:20
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-04-30 20:32
信号肽没有切?那怎么行。你的载体本身有信号肽,你基因又带的有,你想把酵母折腾死啊,另外啊,我建议你看看你的读码框是不是正确的,从载体上的信号肽的ATG开始~,设计工作很重要,不然只能是瞎忙乎,希望对你有所帮助
7楼2010-04-30 16:29:58
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王雨云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-30 16:29:58:
信号肽没有切?那怎么行。你的载体本身有信号肽,你基因又带的有,你想把酵母折腾死啊,另外啊,我建议你看看你的读码框是不是正确的,从载体上的信号肽的ATG开始~,设计工作很重要,不然只能是瞎忙乎,希望对你 ...

你说得太对了,感觉我自己急于求成,所以犯了大错误。现在就是全面设计一下接下来的工作,过几天正式开始重做实验。
8楼2010-04-30 18:51:11
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 王雨云 at 2010-04-30 08:11:27:
不是新的,不过那是我第一次做感受态,可能操作中有什么问题吧。现在做了几次,没有这个问题了,但是就是长不出来,不长菌的原因太多了,实在是不知道从何下手,只有自己慢慢摸索了,不过还是欢迎大家把自己遇到的 ...

试验需要多尝试,一次能够成功?
9楼2010-05-01 22:30:52
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