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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酵母X33电转的问题
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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酵母X33电转的问题 已有5人参与

最近做了几次电转酵母，都不成功。第一次是才开始做，第一次做的感受态好像污染了，电转一天后就长出类似于细菌的东东，接着做了一次感受态，电转一天后长了一颗类似酵母的菌，检测为阴性（按常规方法跑的菌落PCR，有很淡的目的条带，点样孔附近还有很亮的条带，估计是阴性，不知道这步是不是有问题）。前两次的感受态都好像培养过了一点，第三次算是正常的，再按前两次的条件转，3天了什么都没长。我的电转条件是2000v，3~5ms,80ul感受态加了10ul线性化后的质粒，郁闷中，请教实验室同门的同时也请虫友指教一下，谢谢！

[ Last edited by 王雨云 on 2010-4-29 at 09:27 ]
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1楼 2010-04-29 08:24:03
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erosionsdd

禁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽
2楼2010-04-29 21:54:07
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王雨云

金虫 (小有名气)
不是新的，不过那是我第一次做感受态，可能操作中有什么问题吧。现在做了几次，没有这个问题了，但是就是长不出来，不长菌的原因太多了，实在是不知道从何下手，只有自己慢慢摸索了，不过还是欢迎大家把自己遇到的或者看到过的原因来说一说，可以多方面参考一下。
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3楼2010-04-30 08:11:27
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
优化一下电转条件，还有质粒浓度
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4楼2010-04-30 08:28:31
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼上的几位大侠，你们有没有具体的方法参照的呢，能发一下么，谢谢分享～
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5楼2010-04-30 10:15:53
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王雨云

金虫 (小有名气)
貌似我忘了去除信号肽了，实验室有人说基因没切除信号肽可以直接切表达质粒上的，不晓得这样行不行得通，或者影响大不大？
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6楼2010-04-30 16:16:20
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-04-30 20:32
信号肽没有切？那怎么行。你的载体本身有信号肽，你基因又带的有，你想把酵母折腾死啊，另外啊，我建议你看看你的读码框是不是正确的，从载体上的信号肽的ATG开始～，设计工作很重要，不然只能是瞎忙乎，希望对你有所帮助
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7楼2010-04-30 16:29:58
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-30 16:29:58:
信号肽没有切？那怎么行。你的载体本身有信号肽，你基因又带的有，你想把酵母折腾死啊，另外啊，我建议你看看你的读码框是不是正确的，从载体上的信号肽的ATG开始～，设计工作很重要，不然只能是瞎忙乎，希望对你 ...

你说得太对了，感觉我自己急于求成，所以犯了大错误。现在就是全面设计一下接下来的工作，过几天正式开始重做实验。
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8楼2010-04-30 18:51:11
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 王雨云 at 2010-04-30 08:11:27:
不是新的，不过那是我第一次做感受态，可能操作中有什么问题吧。现在做了几次，没有这个问题了，但是就是长不出来，不长菌的原因太多了，实在是不知道从何下手，只有自己慢慢摸索了，不过还是欢迎大家把自己遇到的 ...

试验需要多尝试，一次能够成功？
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9楼2010-05-01 22:30:52
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