应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
231/1返回列表
查看: 4413  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化

请教各位大虾，本人现在在做毕赤酵母的电转化，想问一下：
（1）大家线性化的质粒都加多少啊？我一般都加20微，回收后跑胶也挺亮的，量挺大的，我们的电转杯是400微的，当时买的时候没有注意，现在酵母加进去就有200多微吧，这样子。
（2）电转化后大家是静止培养还是慢摇培养啊？问的别人也是说什么的都有……
（3）最最郁闷的就是后培养后的涂布，我们这边用的都是6cm的小平板，G418浓度时1mg/mL，第一次的时候就是离心全部涂布，然后板上面全部长满，当然有一个师兄说这个是“尸体”以前实验室也没有人做酵母，没有所谓的经验。后来又买了新的G418，做了抗性检验，涂布空的GS115也是长满，这个汗啊，但是没有单菌落，问了别人，也有人说是有菌的，但是转化子是能长出来单菌落的……
码了好多字，大家帮忙看看吧先谢过了！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-12-07 10:45:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lq8609019558

新虫 (初入文坛)
dhmdddd(金币+1):恩，知道了，谢谢！ 2010-12-08 08:30:04
我们一般都是10微升线化质粒（5-10微克）加80微升感受态细胞混匀，静止一小时，涂平板时，应该按不同菌量涂在几个板子上。 你的平板上铺满了菌，没有单科，怀疑是不是你的抗性不够，或是抗性失活了。倒平板时，温度降到60左右，再加抗生素，混匀，倒平板
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2010-12-07 22:34:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):因为我是要高表达的菌株，所以用了G418，你的MM培养基是什么啊？没有用过…… 2010-12-07 11:51:23
线性化的质粒20ul应该算是够了，要求是在5-10ug，只要是是跑胶很亮应该是不成问题，话说回来，质粒量不够，几率还是有的
电转后要慢慢摇，英语说的gentel shake，至于到底多少转，只能自己摸索了
至于G148这个问题，我没有用过，我是用的Bgl线性化的，用MD和MM筛选，最后做PCR克隆来鉴定阳性克隆的
赞一下 回复此楼
2楼2010-12-07 11:09:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

旋木晴晴

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):不要离心的是吧？ 2010-12-07 13:02:33
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板
赞一下 回复此楼
3楼2010-12-07 12:46:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-12-07 12:46:16:
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板

恩，又一次也是涂布量也比较少，结果后来还是长满了，就是平铺，也没有见单菌落……
赞一下 回复此楼
4楼2010-12-07 13:26:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
dhmdddd(金币+1):知道了，谢谢！ 2010-12-07 14:11:17
引用回帖:
Originally posted by dhmdddd at 2010-12-07 10:45:32:
请教各位大虾，本人现在在做毕赤酵母的电转化，想问一下：
（1）大家线性化的质粒都加多少啊？我一般都加20微，回收后跑胶也挺亮的，量挺大的，我们的电转杯是400微的，当时买的时候没有注意，现在酵母加 ...

把10成葡萄糖换成10成甲醇就是MM了
赞一下 回复此楼
5楼2010-12-07 13:53:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
什么载体，什么菌啊

PPIC9K好像要用营养缺陷和抗性双筛选才能出单菌落的
赞一下 回复此楼
6楼2010-12-07 16:11:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2010-12-07 16:11:35:
什么载体，什么菌啊

PPIC9K好像要用营养缺陷和抗性双筛选才能出单菌落的

PPIC9K线性化后转化GS115菌株
赞一下 回复此楼
7楼2010-12-07 16:18:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)
加点Zeosin
回复此楼
9楼2010-12-07 23:35:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)
dhmdddd(金币+1):恩，后来的就不离心了！ 2010-12-08 08:32:23
引用回帖:
Originally posted by 旋木晴晴 at 2010-12-07 12:46:16:
电转后静置放置。电转一次可以涂几块板

不要离心~~
回复此楼
10楼2010-12-07 23:35:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-12-07 23:35:04:
加点Zeosin

那会不会有毕赤酵母GS115不是组氨酸缺陷型的啊？
赞一下 回复此楼
11楼2010-12-08 08:31:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
把你的GS115涂个MD平板看看
赞一下 回复此楼
12楼2010-12-08 08:35:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2010-12-08 08:35:33:
把你的GS115涂个MD平板看看

一直都是用的MD平板，山梨醇融葡萄糖，然后倒板的时候再加YNB，生物素和G418的
赞一下 回复此楼
13楼2010-12-08 08:39:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
dhmdddd(金币+1):恩！ 2010-12-08 08:51:17
我说的是转化前的空菌，看看是否还是营养缺陷菌
赞一下 回复此楼
14楼2010-12-08 08:40:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaocy8903 at 2010-12-08 08:40:52:
我说的是转化前的空菌，看看是否还是营养缺陷菌

我用空菌GS115涂布了，结果也是长满了，但是没有单菌落，是不是本身这个菌就不是组氨酸缺陷型的，有这个可能吗？记得当时师兄给我菌的时候叨叨了一句，因为这个菌也是别人给的……
赞一下 回复此楼
15楼2010-12-08 08:53:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pidou213

木虫 (正式写手)
dhmdddd(金币+1):是啊，涂布量是挺大的，呵呵，在改，在改^-^ 2010-12-08 10:14:17
如果是一片“尸体”，无单克隆菌落的话，我只能说你涂布平板时的菌液量浓度太大了
赞一下 回复此楼
16楼2010-12-08 09:57:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

啊Q精神

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
dhmdddd: 金币+2 2012-08-30 21:43:30
我都没有摇过，电完之后直接涂板
操作手册上是80u酵母加20u线性质粒。电完用1ml山梨醇洗出，然后每200ul-500ul涂一块MD板
涂抗生素G418板的话，菌不能太浓，涂10的5次方的细胞吧大概（1OD为5乘10的7次方个细胞）
赞一下 回复此楼
17楼2012-08-30 14:11:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lymic07

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
18楼2013-09-11 12:00:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

乐云蓝

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaopeiliang at 2010-12-07 11:09:30
线性化的质粒20ul应该算是够了，要求是在5-10ug，只要是是跑胶很亮应该是不成问题，话说回来，质粒量不够，几率还是有的
电转后要慢慢摇，英语说的gentel shake，至于到底多少转，只能自己摸索了
至于G148这个问题 ...

我也是用MD和MM筛选的，可是做PCR克隆都没有啊，请问 PCR程序怎样设置的
赞一下 回复此楼
19楼2014-09-17 10:04:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangsongwei

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次 也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这个问题的呢？谢谢，谢谢，谢谢
赞一下 回复此楼
20楼2014-10-29 19:22:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by wangsongwei at 2014-10-29 19:22:32
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次 也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这 ...

这个还是在学校的时候做的，不太记得了。。不好意思。。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
21楼2014-10-29 22:59:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dhmdddd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by wangsongwei at 2014-10-29 19:22:32
您好，最近我在转化酵母做抗性筛选时也遇到了相关问题。我的线性化片段带有G418抗性基因，转化毕赤酵母X-33后，做G418抗性筛选，0.3mg/ml筛选，做了几次 也是长满平板。是抗性浓度不合适？还是？当时您是怎么解决这 ...

为什么你的片段有G418抗性？空菌有木有问题？还有试试涂布的量少一点看看，没有帮到你抱歉。。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
22楼2014-10-29 23:01:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangsongwei

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
22楼: Originally posted by dhmdddd at 2014-10-29 23:01:30
为什么你的片段有G418抗性？空菌有木有问题？还有试试涂布的量少一点看看，没有帮到你抱歉。。
...

我的外源片段是含有G418抗性基因的，常理来说只有导入外源片段的菌株才有抗性。您用过的抗性浓度是多少呢？
赞一下 回复此楼
23楼2014-10-30 10:20:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 dhmdddd 的主题更新
231/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 压国家一区线，求导师收留，有恩必谢！ +7 迷人的哈哈 2026-03-28 7/350 2026-03-28 16:47 by 催化大白
[考研] 329求调剂 +6 星野? 2026-03-26 6/300 2026-03-28 14:14 by 唐沐儿
[考研] 322求调剂 +5 旧吢 2026-03-24 5/250 2026-03-28 13:26 by Iveryant
[考研] 材料277求调剂 +7 min3 2026-03-24 7/350 2026-03-28 11:39 by xuxiang
[考研] 一志愿哈尔滨工业大学材料与化工方向336分 +8 辰沐5211314 2026-03-26 8/400 2026-03-28 11:25 by xuxiang
[考研] 材料求调剂 一志愿哈工大总分298分，前三科223分 +5 dongfang59 2026-03-27 5/250 2026-03-28 04:53 by wxiongid
[有机交流] 高温高压反应求助 10+4 chibby 2026-03-25 4/200 2026-03-27 21:08 by BT20230424
[考研] 285求调剂 +4 AZMK 2026-03-27 7/350 2026-03-27 20:59 by AZMK
[考研] 266分求材料化工冶金矿业等专业的调剂 +4 哇呼哼呼哼 2026-03-26 4/200 2026-03-27 17:02 by zhyzzh
[考研] 一志愿南师大0703化学 275求调剂 +4 Ripcord上岸 2026-03-27 4/200 2026-03-27 17:00 by zhyzzh
[考研] 调剂推荐 +5 清酒714 2026-03-26 6/300 2026-03-27 11:12 by 不吃魚的貓
[硕博家园] 招收生物学/细胞生物学调剂 +3 IceGuo 2026-03-26 4/200 2026-03-27 05:35 by user003
[考研] 求调剂 +8 Auroracx 2026-03-22 8/400 2026-03-26 19:55 by 不吃魚的貓
[考研] 材料考研求调剂 +3 Dendel 2026-03-23 6/300 2026-03-26 17:51 by fmesaito
[考研] 347求调剂 +4 L when 2026-03-25 4/200 2026-03-25 13:37 by cocolv
[考研] 求调剂 +3 李李不服输 2026-03-25 3/150 2026-03-25 13:03 by cmz0325
[考研] 一志愿吉林大学材料与化工303分求调剂 +4 为学666 2026-03-24 4/200 2026-03-25 11:27 by BruceLiu320
[考研] 一志愿南航材料专317分求调剂 +5 炸呀炸呀炸薯条 2026-03-23 5/250 2026-03-24 16:52 by 星空星月
[考研] 求调剂一志愿武汉理工大学材料工程（085601） +5 WW.' 2026-03-23 7/350 2026-03-24 14:50 by sprinining
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭