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dhmdddd

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化

请教各位大虾，本人现在在做毕赤酵母的电转化，想问一下：
（1）大家线性化的质粒都加多少啊？我一般都加20微，回收后跑胶也挺亮的，量挺大的，我们的电转杯是400微的，当时买的时候没有注意，

现在酵母加进去就有200多微吧，这样子。
（2）电转化后大家是静止培养还是慢摇培养啊？问的别人也是说什么的都有……
（3）最最郁闷的就是后培养后的涂布，我们这边用的都是6cm的小平板，G418浓度时1mg/mL，第一次的时候就是离心全部涂布，然后板上面全部长满，当然有一个师兄说这个是“尸体”

以前实验室也没有人做酵母，没有所谓的经验。后来又买了新的G418，做了抗性检验，涂布空的GS115也是长满，这个汗啊，但是没有单菌落，问了别人，也有人说是有菌的，但是转化子是能长出来单菌落的……
码了好多字，大家帮忙看看吧先谢过了！！

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1楼 2010-12-07 10:45:32

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lq8609019558

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 173.6
帖子: 8
在线: 1.1小时
虫号: 826761

dhmdddd(金币+1):恩，知道了，谢谢！ 2010-12-08 08:30:04

我们一般都是10微升线化质粒（5-10微克）加80微升感受态细胞混匀，静止一小时，涂平板时，应该按不同菌量涂在几个板子上。你的平板上铺满了菌，没有单科，怀疑是不是你的抗性不够，或是抗性失活了。倒平板时，温度降到60左右，再加抗生素，混匀，倒平板

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8楼2010-12-07 22:34:19

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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

应助: 21 (小学生)
金币: 349.1
帖子: 151
在线: 70.4小时
虫号: 1044898

dhmdddd(金币+1):因为我是要高表达的菌株，所以用了G418，你的MM培养基是什么啊？没有用过…… 2010-12-07 11:51:23

线性化的质粒20ul应该算是够了，要求是在5-10ug，只要是是跑胶很亮应该是不成问题，话说回来，质粒量不够，几率还是有的
电转后要慢慢摇，英语说的gentel shake，至于到底多少转，只能自己摸索了
至于G148这个问题，我没有用过，我是用的Bgl线性化的，用MD和MM筛选，最后做PCR克隆来鉴定阳性克隆的

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2楼2010-12-07 11:09:30

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