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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母表达蛋白纯化
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梦中江楼

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达蛋白纯化

本人刚开始做实验，毕赤酵母用甲醇诱导表达的蛋白在培养基中，应该怎样提纯，蛋白加了His-tag标签，用镍和层析怎样处理培养基？求镍和层析的具体纯化步骤。
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1楼 2013-07-21 09:12:48
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦中江楼(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-23 11:38:47
梦中江楼: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-25 08:48:46
这个做过。直接离心去掉菌体，收集上清。镍柱处理好，用20mMTris、20mM磷酸二氢钠‘2水、50mM咪唑、500mM氯化钠，pH7.4做平衡液。咪唑可以看挂柱的效果调节量，氯化钠就是看后面的柱子调节了，如果不怕麻烦透析，就这么加吧。洗脱最开始还是要多设计几个咪唑梯度摸索一下的。
楼上两位虫友的意见我都不是很赞同，分泌表达，肯定不用破碎的。过亲和柱没必要超滤的，除非体积特别大，上样要非常久（10h），太累。条件摸好，亲和柱一洗脱就把目的蛋白浓缩了。
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活到老学到老
5楼2013-07-23 09:03:39
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普通回帖

lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你去看IMAC说明书了，上面应该写的很清楚
不过你现确定酵母的破胞，那个比E.coli麻烦
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2楼2013-07-22 20:51:43
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-23 08:19:17
既然是分泌在培养基中，先过个超滤膜，把蛋白浓缩下，然后溶解在上样缓冲液中，上镍亲和柱，后面的方法就和普通的镍柱亲和层析一样了。
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3楼2013-07-23 07:54:56
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梦中江楼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-07-23 07:54:56
既然是分泌在培养基中，先过个超滤膜，把蛋白浓缩下，然后溶解在上样缓冲液中，上镍亲和柱，后面的方法就和普通的镍柱亲和层析一样了。

我的蛋白在培养基里，是不是说不需要超声破菌这一步，直接上柱就可以了？
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4楼2013-07-23 08:56:38
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梦中江楼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-07-23 09:03:39
这个做过。直接离心去掉菌体，收集上清。镍柱处理好，用20mMTris、20mM磷酸二氢钠‘2水、50mM咪唑、500mM氯化钠，pH7.4做平衡液。咪唑可以看挂柱的效果调节量，氯化钠就是看后面的柱子调节了，如果不怕麻烦透析， ...

我用的是MERCK的试剂盒，这里面有结合、漂洗、洗脱缓冲液，是不是就不用配平衡液了？过柱子是不是和蛋白的量有关，量太少的话，会不会不能结合？
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6楼2013-07-23 09:19:05
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦中江楼 at 2013-07-23 08:56:38
我的蛋白在培养基里，是不是说不需要超声破菌这一步，直接上柱就可以了？...

不需要破碎细胞的。
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7楼2013-07-23 09:30:51
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 梦中江楼 at 2013-07-23 09:19:05
我用的是MERCK的试剂盒，这里面有结合、漂洗、洗脱缓冲液，是不是就不用配平衡液了？过柱子是不是和蛋白的量有关，量太少的话，会不会不能结合？...

这个试剂盒到是没有用过，但是蛋白纯化这东西，不可能一个试剂盒就能解决全部问题的！可以用试剂盒做，但是结合和洗脱的条件可能还是要有一点小改动的。量少不会不结合的，只是出峰了，你紫外检测不到，目的蛋白液会被稀释，量少最好用小柱子。
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活到老学到老
8楼2013-07-23 15:55:16
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田晓会

铁虫 (初入文坛)
我们实验室之前没有人用酵母表达蛋白，我初次用毕赤酵母表达蛋白，载体是pPICZα A，表达量很低，SDS胶检测不到，但WB检测有蛋白，我决定再多培养，可是培养量大了，不知道怎样纯化蛋白，总不能大批菌挂Ni 层析柱子吧，请各位做过酵母的大侠帮忙支招，万分感谢
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9楼2014-05-12 20:11:31
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匿名

用户注销 (小有名气)
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10楼2014-10-27 16:20:13
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