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毕赤酵母表达蛋白纯化
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| 本人刚开始做实验，毕赤酵母用甲醇诱导表达的蛋白在培养基中，应该怎样提纯，蛋白加了His-tag标签，用镍和层析怎样处理培养基？求镍和层析的具体纯化步骤。 |
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 分子生化实验经验积累 |
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lxj341401
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lifuzhu3838
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【答案】应助回帖
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这个做过 。直接离心去掉菌体，收集上清。镍柱处理好，用20mMTris、20mM磷酸二氢钠‘2水、50mM咪唑、500mM氯化钠，pH7.4做平衡液。咪唑可以看挂柱的效果调节量，氯化钠就是看后面的柱子调节了，如果不怕麻烦透析，就这么加吧。洗脱最开始还是要多设计几个咪唑梯度摸索一下的。楼上两位虫友的意见我都不是很赞同，分泌表达，肯定不用破碎的。过亲和柱没必要超滤的，除非体积特别大，上样要非常久（10h），太累。条件摸好，亲和柱一洗脱就把目的蛋白浓缩了。 |
5楼2013-07-23 09:03:39
10