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1楼2012-08-19 21:06:20

alarace

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将连好的质粒送公司测序就可以知道是否连上标签了

2楼2012-08-19 21:10:45

761429495

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谁能给我说说从目的基因开始加组氨酸标签开始一直到粗酶液的获得大体有哪些步骤啊

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3楼2012-08-19 21:16:32

dshlove

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3楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-19 21:16:32

谁能给我说说从目的基因开始加组氨酸标签开始一直到粗酶液的获得大体有哪些步骤啊

粗酶液是什么？我们还不知道你的基因是干嘛的呢，说详细点，不然帮不上。

4楼2012-08-20 14:31:12

761429495

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4楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-20 14:31:12
粗酶液是什么？我们还不知道你的基因是干嘛的呢，说详细点，不然帮不上。...

意思就是我的木聚糖酶基因现在已经在毕赤酵母里面表达了，接下来的工作就是通过给这个基因的C端加组氨酸标签，然后用镍柱亲和层析纯化这个酶蛋白。引物该如何让设计，大概主要步骤有哪些？

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5楼2012-08-20 14:38:39

dshlove

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5楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-20 14:38:39
意思就是我的木聚糖酶基因现在已经在毕赤酵母里面表达了，接下来的工作就是通过给这个基因的C端加组氨酸标签，然后用镍柱亲和层析纯化这个酶蛋白。引物该如何让设计，大概主要步骤有哪些？

...

你当初是怎么把基因弄进去的啊？
现在，你就在基因的3'端（纠正你一点，只有氨基酸才能叫N端C端的）加上组氨酸标签，把组氨酸标签的基因一同视为你的蛋白基因，再设计引物就行了啊。

6楼2012-08-20 14:45:04

761429495

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6楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-20 14:45:04
你当初是怎么把基因弄进去的啊？
现在，你就在基因的3'端（纠正你一点，只有氨基酸才能叫N端C端的）加上组氨酸标签，把组氨酸标签的基因一同视为你的蛋白基因，再设计引物就行了啊。...

哦，嘿嘿，也就是说在下游引物的3'端加标签吗? 基因转化进去的啊

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7楼2012-08-20 14:56:50

dshlove

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7楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-20 14:56:50
哦，嘿嘿，也就是说在下游引物的3'端加标签吗? 基因转化进去的啊...

那你得重新构建了啊。
当初就应该想到把标签加上去的，不然后续纯化很费劲的。
下游引物的5‘加上标签，不是3'哦，方向不能弄反了。因为你是在羧基端加组氨酸标签的，而下游引物也是按照5’--3‘的顺序去设计的，所以，你要加上反向互补的组氨酸标签在下游引物的5’端。

8楼2012-08-20 15:32:22