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1楼2012-08-19 21:06:20

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谁能给我说说从目的基因开始加组氨酸标签开始一直到粗酶液的获得大体有哪些步骤啊

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3楼2012-08-19 21:16:32

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4楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-20 14:31:12
粗酶液是什么？我们还不知道你的基因是干嘛的呢，说详细点，不然帮不上。...

意思就是我的木聚糖酶基因现在已经在毕赤酵母里面表达了，接下来的工作就是通过给这个基因的C端加组氨酸标签，然后用镍柱亲和层析纯化这个酶蛋白。引物该如何让设计，大概主要步骤有哪些？

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5楼2012-08-20 14:38:39

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6楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-20 14:45:04
你当初是怎么把基因弄进去的啊？
现在，你就在基因的3'端（纠正你一点，只有氨基酸才能叫N端C端的）加上组氨酸标签，把组氨酸标签的基因一同视为你的蛋白基因，再设计引物就行了啊。...

哦，嘿嘿，也就是说在下游引物的3'端加标签吗? 基因转化进去的啊

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7楼2012-08-20 14:56:50

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8楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-20 15:32:22
那你得重新构建了啊。
当初就应该想到把标签加上去的，不然后续纯化很费劲的。
下游引物的5‘加上标签，不是3'哦，方向不能弄反了。因为你是在羧基端加组氨酸标签的，而下游引物也是按照5’--3‘的顺序去设计的， ...

亲，我是接别人的课题做，初学者，什么都不懂，谢谢你的指导哦

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9楼2012-08-20 21:11:41

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2楼: Originally posted by alarace at 2012-08-19 21:10:45
将连好的质粒送公司测序就可以知道是否连上标签了

嘿嘿

谢谢

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10楼2012-08-20 21:12:29

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12楼: Originally posted by tanglian8655 at 2012-08-21 08:52:26
不是应该在表达之前就要构建好表达载体的吗？那你的基因在什么载体上，根据载体的性质来确定你的纯化的方式

在PPIC-9K上啊，难道在这个载体上的基因不能用组氨酸标签纯化吗？

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13楼2012-08-21 09:36:48

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15楼: Originally posted by tanglian8655 at 2012-08-21 11:55:48
不是不能用组氨酸标签纯化，如果你一定要用这种纯化方式，你应该考虑几方面：一、你的基因上是不是本身就带有组氨酸标签，如果有，你可以直接纯化；二、如果你基因上没有，就看你的载体上是不是含有组氨酸标签，如 ...

谢谢你这么详细的指导哈

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16楼2012-08-21 13:20:35