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【分享】蛋白质纯化个人总结2
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4、纯化 膜蛋白通常是作为蛋白－脂类－去垢剂的复合物来进行纯化的去垢剂分子的浓度应该在其CMC值以上但是可以固定在溶解时所加浓度的10倍以下（通常是在0.1％的浓度范围内）。 （1）组氨酸标签膜蛋白的纯化 组氨酸标签蛋白对于Ni2+以及其它几个金属离子具有亲和性，使用螯合配体能够将这些金属离子固定在色谱层析介质上。含有组氨酸标签的蛋白能够特异性地结合在带有金属离子的介质上如Ni Sepharose High Performance (HP) and Ni Sepharose 6 Fast Flow (FF)，而大多数其它胞内蛋白不能结合或者结合很弱。提高咪唑的浓度可以将蛋白洗脱下来。这种色谱层析技术通常被称为螯合金属离子亲和层析（IMAC）。 带有6个组氨酸标签的水溶性蛋白通常可以参照标准流程直接进行纯化。组氨酸标签的膜蛋白有时较麻烦，与IMAC结合较弱。这可能是由于去垢剂与蛋白的结合限制了组氨酸标签与IMAC配体之间接触。为了解决这个问题，一般采用更长的组氨酸标签来进行膜蛋白过表达。另外，在组氨酸标签和目的膜蛋白之间加入连接片段如绿色荧光蛋白（GFP）可能会帮助结合IMAC介质。 过去相当长一段时间内，人们经常使用批量方法来纯化组氨酸标签的膜蛋白。批量纯化是指在一个指定时间内将样品与色谱层析介质在一个开放的容器内混合，一般是过夜混合。然后，将这个悬液装入一根柱子内进行漂洗以及洗脱。批量纯化有时能够提高产量，因为样品与介质的吸附时间比柱上分离要长。另一方面，正因为实验过程长，批量纯化会使得蛋白更易于遭受到蛋白酶降解或者导致失活，并且因此降低纯化蛋白的质量。 （2）其它的纯化步骤 在应用上需要进一步纯化IMAC纯化过的组氨酸膜蛋白以满足对高纯度均一物质的需求（如结构鉴定）。一个或者更多色谱层析步骤就足矣了。为了达到最高纯化效率，需要将各种分离原理运用在纯化流程的不同步骤中。 一个高效的纯化流程是由IMAC（根据特异性亲和进行分离），脱盐和离子交换层析（根据电荷不同进行分离），最后是分子筛层析（根据大小不同进行分离）。分子筛层析最常用于最后一步纯化以最后除去聚集体并且还可用于将样品更换到适于进一步功能和结构研究的缓冲液中。分离是在高于CMC值的去垢剂存在情况下进行的（一般是大于0.1％）。其它条件和提取水溶性蛋白是一样的。表1.6列举出了一些合适的柱子。ÄKTAxpress™层析系统可以在最短操作时间内进行多步自动化纯化来生产高纯度的蛋白质。高效阴离子交换层析既可用于纯化也可对纯化好的膜蛋白的电荷均一性进行鉴定。在大多数情况下，在上样到离子交换层析柱以前，要降低IMAC处理过的样品中离子强度。 5、切除标签 如果蛋白酶切割位点位于标签和目的蛋白之间，可以在纯化之后将标签切割下来。使用ÄKTAxpress系统可以自动进行标签的柱上切割。去垢剂的存在能够影响蛋白酶的活力。关于各种蛋白酶在去垢剂中的活力信息十分匮乏。但是，PreScission™蛋白酶和凝血酶可以同去垢剂一同使用。建议使用SDS-PAGE监测不同条件下标签的切割程度（参见40页上“纯度和均一性”监测）。 无标签膜蛋白的纯化 天然资源比异源宿主更适于作为原材料来提纯膜蛋白。由于缺乏亲和标签以及因此而采用的高度特异性的初始纯化步骤，通常需要联合使用多种经典的蛋白质纯化技术才能达到足够的纯度。离子交换层析也经常作为主要步骤用于无标签膜蛋白的纯化。避免在阴离子交换层析柱使用阴离子去垢剂，在阳离子交换层析柱上使用阳离子去垢剂。如上所述，在膜蛋白的纯化流程中，分子筛层析是理想化的最终步骤。在分子筛上可以除去聚集体以及与目的蛋白分子大小不同的杂质，同时还可以进行缓冲液更换。 6、纯度与均一性鉴定 （1）均一性监测 和水溶性蛋白一样，SDS-PAGE是最为广泛的监测膜蛋白纯度的方法。考马斯亮蓝、银染或者Deep PurpleTM（用于荧光检测）可用于检测 （2）分子量大小均一性鉴定 聚集通常不能用SDS-PAGE 来进行监测，因为SDS能够溶解大多数聚集体。分子筛层析是监测聚集的快速方法，可以在很广泛的条件下使用。这种方法可以有效地由于监测纯化的膜蛋白样品的分子量均一性 （3）电荷均一性鉴定 高分辨率的阴离子交换层析广泛用于膜蛋白的纯化，通常在IMAC后作为第二步色谱层析步骤。它也是一种对纯化的膜蛋白进行电荷均一性鉴定的好方法。 （4）Conditioning 纯化好的膜蛋白经常需要被浓缩或者转移至一个适于进一步分析的环境中。通常的操作包括浓缩、脱盐、更换缓冲液、更换去垢剂以及清除去垢剂 三、多蛋白复合物 1、Pull-down 实验 Pull-down实验是利用将复合物吸附到树脂上来分离蛋白质复合物。通过亲和标签（如GST、组氨酸、麦芽糖结合蛋白等）或抗体，树脂上耦联的配体特异性地结合复合物中地组分。Pulldown实验经常用于小量分离复合物（μg），主要用于鉴定每一种亚基。该实验也用于分离特定功能研究所需材料，但是其它方法看来更适于大量制备（mg）。通常捕获到的复合物组分是通过质谱最终分析并对其亚基构成加以鉴定的。Pull-down是研究蛋白－蛋白相互作用网络的重要工具。 2、亲和Pull-down实验 亲和Pull-down实验已经很好地用于分离以及随后鉴定蛋白质复合物（见文献5）。GST Pull-down实验是利用带有GST标签的诱饵蛋白从一个生物样品中亲和纯化一个或几个未知蛋白。主要原理就是带有GST标签的诱饵蛋白与其相互作用蛋白结合，所产生的复合物被捕获在连有谷胱甘肽的树脂上。为排除假阳性所设的一组对照实验是在没有诱饵蛋白存在的条件下，将样品结合到GST上。该对照可以是表达有GST（非诱饵融合蛋白）的分别转化细胞裂解物，也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中。设计合适的对照实验非常重要。 3、串联亲和层析纯化，TAP 本方法通过修正或直接用于纯化并鉴定酵母菌、锥体虫、果蝇、人类以及植物中的复合物。 （参照文献8）。TAP与早期描述的方法不同之处在于，其利用连续两步亲和层析来分离蛋白质复合物。两步亲和层析目的是提高纯化过程的特异性继而降低假阳性出现的几率。本方法所使用的每一个条件都很温和，这样是为了保持复合物的完整性并且保证产量的最大化。本方法已成功用在很多案例中。 图2.5显示了TAP的基本原理。简单地说，就是一个诱饵蛋白（一个已知或假想地复合物组分）同时带上蛋白A和钙调素结合肽（CBP）两个标签，在这两个标签之间含有烟草花叶病毒（TEV）切割位点。这种双标签蛋白以接近自然水平表达，因为过表达会导致非生理性相互作用。该复合物首先利用蛋白A标签吸附到IgG Sepharose树脂上，然后借助于TEV切割，被洗脱下来。接下来，该复合物又结合到钙调素Sepharose树脂上（借助于CBP标签），然后用EGTA洗脱下来。最后，该复合物组分用SDS-PAGE分离并通过质谱进行分析。 4、免疫共沉淀 免疫共沉淀是利用抗体来从生物样品粗品中分离抗原的一种成熟技术。该命名是有着历史渊源的 ，其由来是基于以正确比例混合抗原和抗体时能够产生沉淀的原理。这里所介绍的方法是一种pull-down方法而不是沉淀反应。免疫共沉淀使用复合物中一种组分（已知或假想的）的抗体（含标签）。该抗体同其抗原也就是多蛋白复合物的一部分结合。将蛋白A或蛋白G Sepharose树脂加到混合物后，该抗体－蛋白复合物被捕获。具体原理见图2.6。另外，一种合适的抗体也能固定在一种活性基质上，如NHS活化的Sepharose。同样地，一种抗体也能交联到蛋白A或蛋白G介质上并将蛋白复合物组分给免疫共沉淀下来。 四、重组蛋白复合物的分离 包涵体 在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来。这些包涵体蛋白是丧失生活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体，在phase microscopy下可以作为黑色细胞颗粒被观察到。包涵体大小在0.2－0.6μm之间。变性的重组蛋白是包涵体的主要成分，因此通过离心对包涵体进行初始分离是有效的纯化步骤。天然重组蛋白通过一个称作复性的步骤从包涵体中回收得到。尽管小蛋白可以直接复性，但是在很多情况下，对于那些不含有二硫键的蛋白而言，直接复性仍然是很困难的。复性的最佳条件因蛋白而异，不能预测。 纯化的特殊之处在于:包涵体分离、溶解以及复性 1、包涵体分离 破碎细胞后，通过离心来分离包涵体。这是高效的纯化步骤，因为靶蛋白经常是包涵体的主要成分DNA、膜囊泡以及细胞壁碎片与包涵体大小相近，因此在离心时，可以和包涵体一同被沉降下来。产生细胞碎片的大小取决于破碎细胞所采用的方法。经常使用的是高压匀浆以及超声破碎。 1\高压匀浆（在20 000 psi下用French press进行 3轮破碎）能够减小细胞碎片，因此在离心时可以与包涵体立即分离。 2\细胞破碎后，加入Dnase（如10－20μg/ml）将减少污染DNA，而加入去垢剂（如1％Triton X-100）能够减少与包涵体相连的膜物质。 2、复性 复性方法: 透析, 稀释, 分子筛层析, 离子交换层析 通常，要保证复性成功要仔细优化大量参数： • 蛋白浓度 • 温度 • 反应时间 • 二硫化物交换试剂（如下） • 缓冲液添加剂 缓冲液添加剂是通过抑制聚集体形成（如尿素或者盐酸胍）或者提高折叠效率（精氨酸、甘油、盐）而起作用的。 1、利用分子筛复性 分子筛复性是利用这种树脂通过一种“cage-like”效应来抑制聚集的特点。另外，通过分子筛不断地除去复性过程中连续产生的聚集体也可能提高复性产率。原因在于：即便是少量聚集体的存在也能加速进一步的聚集。从理论上讲，分子筛比简单稀释或者透析更能帮助复性（提高复性产率）。目前采用了两种不同的实验策略。一种是用复性缓冲液来平衡柱子。然后把含有溶解状态包涵体（在溶解缓冲液中）的样品上到柱子中。在通过柱子的过程中，溶解缓冲液的组分滞留在柱上，因此蛋白被转移到一个无变性剂的环境中。 另一种策略是用溶解缓冲液来平衡柱子，或者在上样前把柱子用以梯度性降低比例混合的溶解缓冲液和复性缓冲液来平衡柱子。然后用复性缓冲液来洗脱蛋白。这第二种方法是渐进性地将蛋白转换到一个无变性剂的环境中，很多情况证明这种做法是可取的 2、利用IMAC对带有组氨酸标签的蛋白进行复性 在一种吸附性介质（如IMAC或者离子交换介质）上进行复性，变性蛋白会可逆性地固定在其上。这种固定在接下来除去变性剂时有利于防止聚集体形成。这种吸附技术的另一个优点是：只要在介质的结合能力范围内，对于样品的体积没有要求。带有大亲和标签和/或大蛋白质亲和配体的亲和体系经常不适于柱上复性。对于这种体系，标签和亲和配体之间的结合经常依赖于标签、配体或者两者的正确构象。在变性条件下，他们之间就不会相互结合。使用带有组氨酸标签的蛋白使得一种简单但有效的组合纯化方法以及柱上复性法成为可能。 3、使用离子交换色谱层析来进行复性 与IMAC相同，用离子交换层析复性需要变性蛋白可逆性地固定在树脂上。这种固定在接下来除去变性剂时能够防止聚集体的形成。对于带有组氨酸标签的蛋白而言，吸附到IMAC介质上的条件基本相同，但是吸附到离子交换树脂上的条件将因目的蛋白的电荷性质而定。阳离子交换树脂（如SP Sepharose）和阴离子交换树脂（如Q Sepharose）已成功用于复性。与离子交换树脂结合通常需要低离子强度（也就是<0.1）。低pH能够促进与阳离子交换树脂结合，而高pH则能够促进与阴离子交换树脂结合。 4、复性的分析 一个复性实验成果的全面鉴定可能包括测试生物学活性、均一性的理化性质鉴定以及二级结构鉴定（经常使用圆二色谱）。在很多情况下，特别是对于那些未知功能的蛋白质，这种鉴定程序是不可能或者是不利于进行的。通常用分子筛进行均一性鉴定足以检验复性是否成功。 |
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