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11楼2012-08-21 08:38:51

tanglian8655

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不是应该在表达之前就要构建好表达载体的吗？那你的基因在什么载体上，根据载体的性质来确定你的纯化的方式

12楼2012-08-21 08:52:26

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12楼: Originally posted by tanglian8655 at 2012-08-21 08:52:26
不是应该在表达之前就要构建好表达载体的吗？那你的基因在什么载体上，根据载体的性质来确定你的纯化的方式

在PPIC-9K上啊，难道在这个载体上的基因不能用组氨酸标签纯化吗？

每一个让你讨厌的现在，都有一个不努力的曾经。

13楼2012-08-21 09:36:48

tanglian8655

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13楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-21 09:36:48
在PPIC-9K上啊，难道在这个载体上的基因不能用组氨酸标签纯化吗？...

要看你的载体有什么特点的嘛，看她是不是本身就自带了标签，根据他来决定你的纯化方式，实在不行，你又非得用这种纯化方式，你也可以设计一个引物，把你的基因从原来的载体上切下来，在连到合适的载体上，这样顺利的话最多也就是1-2周

14楼2012-08-21 11:39:58

tanglian8655

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小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-08-22 15:09:51

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13楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-21 09:36:48
在PPIC-9K上啊，难道在这个载体上的基因不能用组氨酸标签纯化吗？...

不是不能用组氨酸标签纯化，如果你一定要用这种纯化方式，你应该考虑几方面：一、你的基因上是不是本身就带有组氨酸标签，如果有，你可以直接纯化；二、如果你基因上没有，就看你的载体上是不是含有组氨酸标签，如果有，就直接做；三、如果前两者都没有，你可以考虑重新构建一个载体，把目的基因从载体上切下来或者设计PCR引物扩增出来，选择一个含有组氨酸标签的载体，比如pET30a，连上去重新构建。这样就可以解决你的问题了

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761429495

15楼2012-08-21 11:55:48

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15楼: Originally posted by tanglian8655 at 2012-08-21 11:55:48
不是不能用组氨酸标签纯化，如果你一定要用这种纯化方式，你应该考虑几方面：一、你的基因上是不是本身就带有组氨酸标签，如果有，你可以直接纯化；二、如果你基因上没有，就看你的载体上是不是含有组氨酸标签，如 ...

谢谢你这么详细的指导哈

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16楼2012-08-21 13:20:35

761429495

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8楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-20 15:32:22
那你得重新构建了啊。
当初就应该想到把标签加上去的，不然后续纯化很费劲的。
下游引物的5‘加上标签，不是3'哦，方向不能弄反了。因为你是在羧基端加组氨酸标签的，而下游引物也是按照5’--3‘的顺序去设计的， ...

大侠啊，那引物上要不要加酶切位点呢？

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17楼2012-08-21 14:02:17

dshlove

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17楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-21 14:02:17
大侠啊，那引物上要不要加酶切位点呢？...

你是用双酶切的方法去连接吗？如果是的话，就需要设计引物时候，加上酶切位点，还要加上保护碱基。

18楼2012-08-21 14:30:29

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18楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-21 14:30:29
你是用双酶切的方法去连接吗？如果是的话，就需要设计引物时候，加上酶切位点，还要加上保护碱基。...

我PCR完后，不是要拿回收产物与PMD-19T连接，然后转化大肠杆菌，重组质粒拿去测序看是不是组氨酸标签已经加上去了。所以与PMD-19T连接时候需要给引物加酶切位点吗？如果加上去的话再另外设计带有酶切位点的引物PCR，双酶切，与PPIC-9K连接转化到毕赤酵母里面。你看这个过程合适着吗？

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19楼2012-08-21 15:30:08

dshlove

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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-22 15:10:09

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19楼: Originally posted by 761429495 at 2012-08-21 15:30:08
我PCR完后，不是要拿回收产物与PMD-19T连接，然后转化大肠杆菌，重组质粒拿去测序看是不是组氨酸标签已经加上去了。所以与PMD-19T连接时候需要给引物加酶切位点吗？如果加上去的话再另外设计带有酶切位点的引物PCR ...

前面的步骤没必要，你验证加上去之后，不还要切下来再连到9K上，费那劲，还不如你直接在9K上连接。
给你个大致步骤：
多提点9K的质粒，也用双酶切处理，做载体。你的PCR产物酶切之后，直接用T4连接酶往载体上连接。之后转化，提质粒。
把提出来的质粒酶切后跑胶验证，再送去测序，直接测AOX1的3‘到AOX1的5'端这段就行。然后比对序列。

20楼2012-08-21 16:33:20