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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母表达一直不表达
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达一直不表达已有2人参与

大家好，我是一个做酵母表达的初学者，我现在做了好久了结果一直没表达，现叙述过程如下：我用PCR鉴定正确已成功整合到酵母基因组的菌落进行表达，我先用YPDS培养基摇正确的菌落大致摇23h左右，然后按1%的比例接种到25ml BMGY培养基中的，然后摇24h左右OD值大致是2.7-2.8之间，我用4000r离心10分钟，弃上清，然后用我预先配好的100ml BMMY培养基其中的一部分把上述菌体先悬浮，然后全部加到BMMY培养基中开始诱导表达，按1%的补加甲醇量每24h补加一次，每24h取一次样，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法进行浓缩的，我是做个梯度分别用的是1ml，3ml，5ml上清来进行浓缩的，然后最后加到上样量用SDS-PAGE法进行鉴定，我的蛋白大小时15KD左右，用的是考马斯亮蓝染色法然后进行脱色，结果条带还是几乎跟看不到似的，哪位高手指导一下我哪步需要改进，哪步做的有问题吗？不甚感谢哦！
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1楼2012-09-05 14:49:41
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 几个帖子一起给予EPI，谢谢对分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-09-06 09:42:21
是的，我觉得我电转化效率低的原因可能与电转仪有很大关系，虽然少但是长出的菌落进行鉴定也都是正确的也都整合到酵母基因组当中了啊，像你们一般筛选30多个，如果这30多个鉴定都正确的话，你都进行表达了啊？应该 ...

我们筛选30个，但是最终鉴定正确的却不多哦，当然也分批次去表达测试。一次弄不过来这么多，不像是大肠杆菌啊。
我觉得上清的量是次要因素，主要是你的蛋白浓度决定的。
我们一般是用硫酸铵沉淀，不过硫酸铵沉淀要求蛋白浓度是1mg/ml,但是硫酸铵在蛋白的稳定性方面还是很好的。看你的蛋白像是降解了，若蛋白浓度不高此方法仅供参考。
如果你的蛋白浓度低的话，我给一种方法，参考下：
以1ml上清为例，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC，
室温放置10min，
在加入50ul 100%TCA。
这种方法适合蛋白浓度小于1ug/ml的低浓度情况下，注意，不要有SDS哦。
希望能帮上。
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XUMIN6891
6楼2012-09-06 10:09:22
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爨乡主人

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

酵母的阳性转化子需要大量筛选的，表不表达跟你的基因整合在酵母的基因组的位置也有关系，我第一次做的都没有筛出能表达的转化子，重新电转了一批，基本都能筛出来有表达的转化子。
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12楼2014-10-27 20:15:18
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你筛选了多拷贝转化子了嘛？
没有表达也有可能是你的表达量太少了，你可以多取点样浓缩试试。或者就直接做个WB.
也有可能就没有分泌出来，破碎下细胞跑胶看看？
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2楼2012-09-05 15:16:56
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
XUMIN6891: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-06 20:22:49
引用回帖:
7楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-09-06 10:21:44
很感谢您的回复啊，但是有一点我还是不太明白，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC，这个0.15%DOC是什么东西啊我刚刚百度一下也没找出来，那个TCA我知道，就直接加完TCA就做完了吗，然后加1倍的上样缓冲液跑电泳吗，能不能把 ...

哦，不好意思，让你困惑了。
就三步哦，DOC是脱氧胆酸盐。我用的是脱氧胆酸钠。
1.1ml上清加0.1ml 0.15%DOC
2.混匀并在室温下放置10min
3.加入50ul 100%TCA,混匀，10，000Xg,5min。
这是TCA的一种变通形式哦，剩下的就一样了。
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8楼2012-09-06 10:29:05
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普通回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-05 15:16:56
你筛选了多拷贝转化子了嘛？
没有表达也有可能是你的表达量太少了，你可以多取点样浓缩试试。或者就直接做个WB.
也有可能就没有分泌出来，破碎下细胞跑胶看看？

因为我们这的电转移不是太好只能设个电压和时间并且电压最高是1100v时间也只能设4ms，，所以电转化到酵母细胞GS115后，就只长11个菌落，然后依次把它分区点种到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博莱霉素板上，我第一次做所以就先挑了8个，提酵母DNA鉴定都正确，但是做完表达后最多用5ml的上清进行TCA浓缩，裂解后的沉淀我也跑了条带也不是太亮，如果我要做WB，我用那个his单抗行不行，因为我这个蛋白没有特异性的抗体，你们一般筛选多少个转化子啊？
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3楼2012-09-06 08:13:57
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-09-06 08:13:57
因为我们这的电转移不是太好只能设个电压和时间并且电压最高是1100v时间也只能设4ms，，所以电转化到酵母细胞GS115后，就只长11个菌落，然后依次把它分区点种到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博莱霉素板上 ...

WB我做的少，不了解你的情况不好发表意见。
你的电转化效率是有点低啊，菌落数太少，所以供你筛选的转化子也就少了了。我们一般至少筛选30个以上的，而且能长的还不多。
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4楼2012-09-06 08:44:57
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-06 08:44:57
WB我做的少，不了解你的情况不好发表意见。
你的电转化效率是有点低啊，菌落数太少，所以供你筛选的转化子也就少了了。我们一般至少筛选30个以上的，而且能长的还不多。...

是的，我觉得我电转化效率低的原因可能与电转仪有很大关系，虽然少但是长出的菌落进行鉴定也都是正确的也都整合到酵母基因组当中了啊，像你们一般筛选30多个，如果这30多个鉴定都正确的话，你都进行表达了啊？应该是分批进行表达的，一次不可能做这么多把？还有个问题是你一般对收集的样品进行TCA浓缩的时候，最多用过多少量的上清进行浓缩啊，我最多用的是5ml，还是不太明显但似乎又有点条带！我也不知道该怎么办！给指导一下把！
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5楼2012-09-06 09:42:21
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-06 10:09:22
我们筛选30个，但是最终鉴定正确的却不多哦，当然也分批次去表达测试。一次弄不过来这么多，不像是大肠杆菌啊。
我觉得上清的量是次要因素，主要是你的蛋白浓度决定的。
我们一般是用硫酸铵沉淀，不过硫酸铵沉淀 ...

很感谢您的回复啊，但是有一点我还是不太明白，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC，这个0.15%DOC是什么东西啊我刚刚百度一下也没找出来，那个TCA我知道，就直接加完TCA就做完了吗，然后加1倍的上样缓冲液跑电泳吗，能不能把你给我说的这种方法再写具体点啊，不甚感激啊！
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7楼2012-09-06 10:21:44
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ptzhyding06

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

为啥不试试小量的10KDa的超滤离心管，一般浓缩10倍应该能看清条带了吧
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9楼2013-04-14 18:38:16
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-06 10:29:05
哦，不好意思，让你困惑了。
就三步哦，DOC是脱氧胆酸盐。我用的是脱氧胆酸钠。
1.1ml上清加0.1ml 0.15%DOC
2.混匀并在室温下放置10min
3.加入50ul 100%TCA,混匀，10，000Xg,5min。
这是TCA的一种变通形式哦， ...

想问一下 做完就离心去掉上清是么？
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做出色的科研人
10楼2013-04-30 11:19:40
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