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XUMIN6891金虫 (初入文坛)
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毕赤酵母表达一直不表达 已有2人参与
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| 大家好，我是一个做酵母表达的初学者，我现在做了好久了结果一直没表达，现叙述过程如下：我用PCR鉴定正确已成功整合到酵母基因组的菌落进行表达，我先用YPDS培养基摇正确的菌落大致摇23h左右，然后按1%的比例接种到25ml BMGY培养基中的，然后摇24h左右OD值大致是2.7-2.8之间，我用4000r离心10分钟，弃上清，然后用我预先配好的100ml BMMY培养基其中的一部分把上述菌体先悬浮，然后全部加到BMMY培养基中开始诱导表达，按1%的补加甲醇量每24h补加一次，每24h取一次样，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法进行浓缩的，我是做个梯度分别用的是1ml，3ml，5ml上清来进行浓缩的，然后最后加到上样量用SDS-PAGE法进行鉴定，我的蛋白大小时15KD左右，用的是考马斯亮蓝染色法然后进行脱色，结果条带还是几乎跟看不到似的，哪位高手指导一下我哪步需要改进，哪步做的有问题吗？不甚感谢哦！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 酵母表达纯化一站式解决！ | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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12楼2014-10-27 20:15:18
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2楼2012-09-05 15:16:56
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 几个帖子一起给予EPI，谢谢对分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 几个帖子一起给予EPI，谢谢对分子版的支持 2012-09-06 13:49:31
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我们筛选30个，但是最终鉴定正确的却不多哦，当然也分批次去表达测试。一次弄不过来这么多，不像是大肠杆菌啊。 我觉得上清的量是次要因素，主要是你的蛋白浓度决定的。 我们一般是用硫酸铵沉淀，不过硫酸铵沉淀要求蛋白浓度是1mg/ml,但是硫酸铵在蛋白的稳定性方面还是很好的。看你的蛋白像是降解了，若蛋白浓度不高此方法仅供参考。 如果你的蛋白浓度低的话，我给一种方法，参考下： 以1ml上清为例，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC， 室温放置10min， 在加入50ul 100%TCA。 这种方法适合蛋白浓度小于1ug/ml的低浓度情况下，注意，不要有SDS哦。 希望能帮上。  |
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XUMIN68916楼2012-09-06 10:09:22
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