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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母表达一直不表达
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达一直不表达 已有2人参与

大家好，我是一个做酵母表达的初学者，我现在做了好久了结果一直没表达，现叙述过程如下：我用PCR鉴定正确已成功整合到酵母基因组的菌落进行表达，我先用YPDS培养基摇正确的菌落大致摇23h左右，然后按1%的比例接种到25ml BMGY培养基中的，然后摇24h左右OD值大致是2.7-2.8之间，我用4000r离心10分钟，弃上清，然后用我预先配好的100ml BMMY培养基其中的一部分把上述菌体先悬浮，然后全部加到BMMY培养基中开始诱导表达，按1%的补加甲醇量每24h补加一次，每24h取一次样，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法进行浓缩的，我是做个梯度分别用的是1ml，3ml，5ml上清来进行浓缩的，然后最后加到上样量用SDS-PAGE法进行鉴定，我的蛋白大小时15KD左右，用的是考马斯亮蓝染色法然后进行脱色，结果条带还是几乎跟看不到似的，哪位高手指导一下我哪步需要改进，哪步做的有问题吗？不甚感谢哦！
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1楼 2012-09-05 14:49:41
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-06 10:09:22
我们筛选30个，但是最终鉴定正确的却不多哦，当然也分批次去表达测试。一次弄不过来这么多，不像是大肠杆菌啊。
我觉得上清的量是次要因素，主要是你的蛋白浓度决定的。
我们一般是用硫酸铵沉淀，不过硫酸铵沉淀 ...

很感谢您的回复啊，但是有一点我还是不太明白，1ml上清加0.1ml 0.15%DOC，这个0.15%DOC是什么东西啊我刚刚百度一下也没找出来，那个TCA我知道，就直接加完TCA就做完了吗，然后加1倍的上样缓冲液跑电泳吗，能不能把你给我说的这种方法再写具体点啊，不甚感激啊！
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7楼2012-09-06 10:21:44
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你筛选了多拷贝转化子了嘛？
没有表达也有可能是你的表达量太少了，你可以多取点样浓缩试试。或者就直接做个WB.
也有可能就没有分泌出来，破碎下细胞跑胶看看？
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2楼2012-09-05 15:16:56
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-05 15:16:56
你筛选了多拷贝转化子了嘛？
没有表达也有可能是你的表达量太少了，你可以多取点样浓缩试试。或者就直接做个WB.
也有可能就没有分泌出来，破碎下细胞跑胶看看？

因为我们这的电转移不是太好只能设个电压和时间并且电压最高是1100v时间也只能设4ms，，所以电转化到酵母细胞GS115后，就只长11个菌落，然后依次把它分区点种到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博莱霉素板上，我第一次做所以就先挑了8个，提酵母DNA鉴定都正确，但是做完表达后最多用5ml的上清进行TCA浓缩，裂解后的沉淀我也跑了条带也不是太亮，如果我要做WB，我用那个his单抗行不行，因为我这个蛋白没有特异性的抗体，你们一般筛选多少个转化子啊？
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3楼2012-09-06 08:13:57
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-09-06 08:13:57
因为我们这的电转移不是太好只能设个电压和时间并且电压最高是1100v时间也只能设4ms，，所以电转化到酵母细胞GS115后，就只长11个菌落，然后依次把它分区点种到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博莱霉素板上 ...

WB我做的少，不了解你的情况不好发表意见。
你的电转化效率是有点低啊，菌落数太少，所以供你筛选的转化子也就少了了。我们一般至少筛选30个以上的，而且能长的还不多。
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4楼2012-09-06 08:44:57
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