应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母表达一直不表达
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 3734  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达一直不表达 已有2人参与

大家好，我是一个做酵母表达的初学者，我现在做了好久了结果一直没表达，现叙述过程如下：我用PCR鉴定正确已成功整合到酵母基因组的菌落进行表达，我先用YPDS培养基摇正确的菌落大致摇23h左右，然后按1%的比例接种到25ml BMGY培养基中的，然后摇24h左右OD值大致是2.7-2.8之间，我用4000r离心10分钟，弃上清，然后用我预先配好的100ml BMMY培养基其中的一部分把上述菌体先悬浮，然后全部加到BMMY培养基中开始诱导表达，按1%的补加甲醇量每24h补加一次，每24h取一次样，前2天我是每次取1ml，到96h-168h我都是取得10ml，然后我用TCA方法进行浓缩的，我是做个梯度分别用的是1ml，3ml，5ml上清来进行浓缩的，然后最后加到上样量用SDS-PAGE法进行鉴定，我的蛋白大小时15KD左右，用的是考马斯亮蓝染色法然后进行脱色，结果条带还是几乎跟看不到似的，哪位高手指导一下我哪步需要改进，哪步做的有问题吗？不甚感谢哦！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖 酵母表达纯化一站式解决！ 蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-05 14:49:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ptzhyding06

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

为啥不试试小量的10KDa的超滤离心管，一般浓缩10倍应该能看清条带了吧
赞一下 回复此楼
9楼2013-04-14 18:38:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你筛选了多拷贝转化子了嘛？
没有表达也有可能是你的表达量太少了，你可以多取点样浓缩试试。或者就直接做个WB.
也有可能就没有分泌出来，破碎下细胞跑胶看看？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-09-05 15:16:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-05 15:16:56
你筛选了多拷贝转化子了嘛？
没有表达也有可能是你的表达量太少了，你可以多取点样浓缩试试。或者就直接做个WB.
也有可能就没有分泌出来，破碎下细胞跑胶看看？

因为我们这的电转移不是太好只能设个电压和时间并且电压最高是1100v时间也只能设4ms，，所以电转化到酵母细胞GS115后，就只长11个菌落，然后依次把它分区点种到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博莱霉素板上，我第一次做所以就先挑了8个，提酵母DNA鉴定都正确，但是做完表达后最多用5ml的上清进行TCA浓缩，裂解后的沉淀我也跑了条带也不是太亮，如果我要做WB，我用那个his单抗行不行，因为我这个蛋白没有特异性的抗体，你们一般筛选多少个转化子啊？
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-06 08:13:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-09-06 08:13:57
因为我们这的电转移不是太好只能设个电压和时间并且电压最高是1100v时间也只能设4ms，，所以电转化到酵母细胞GS115后，就只长11个菌落，然后依次把它分区点种到200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml博莱霉素板上 ...

WB我做的少，不了解你的情况不好发表意见。
你的电转化效率是有点低啊，菌落数太少，所以供你筛选的转化子也就少了了。我们一般至少筛选30个以上的，而且能长的还不多。
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-06 08:44:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 22408 359分调剂 +3 Qshers 2026-03-27 4/200 2026-03-28 16:45 by Qshers
[考研] 复试调剂 +3 raojunqi0129 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:27 by 落睿可思
[考研] 394求调剂 +3 好事多磨静候佳� 2026-03-26 5/250 2026-03-28 14:24 by 唐沐儿
[考研] 一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。 +6 nnnnnnn5 2026-03-25 6/300 2026-03-28 13:33 by 果果妈咪
[考研] 311求调剂 +4 冬十三 2026-03-24 4/200 2026-03-28 13:17 by 唐沐儿
[考研] 085405 考的11408求各位老师带走 +3 Qiu学ing 2026-03-28 3/150 2026-03-28 09:19 by 乐呵呵的追梦人
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +8 曼111 2026-03-24 9/450 2026-03-28 07:58 by YYYYX1234
[考研] 085404求调剂，总分309，本科经历较为丰富 +4 来财aa 2026-03-25 4/200 2026-03-28 07:41 by 棒棒球手
[考研] 303求调剂 +7 安忆灵 2026-03-22 8/400 2026-03-27 11:46 by sanrepian
[考研] 314求调剂 +3 溪云珂 2026-03-26 3/150 2026-03-27 11:20 by sanrepian
[考研] 359求调剂 +4 王了个楠 2026-03-25 4/200 2026-03-27 08:43 by 不吃魚的貓
[考研] 284求调剂 +11 junqihahaha 2026-03-26 12/600 2026-03-27 04:37 by wxiongid
[考研] 351求调剂 +4 麦克阿磊 2026-03-24 4/200 2026-03-27 00:32 by wxiongid
[考研] 321求调剂 +6 wasdssaa 2026-03-26 6/300 2026-03-26 20:57 by sanrepian
[考研] 0703化学求调剂 +3 丹青奶盖 2026-03-26 5/250 2026-03-26 20:11 by macy2011
[考研] 309求调剂 +4 gajsj 2026-03-25 5/250 2026-03-26 00:27 by Dyhoer
[考研] 290分调剂求助 +3 吉祥止止陈 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:58 by barlinike
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭