| 查看: 3332 | 回复: 19 | |||||
| 本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | |||||
liyouran85金虫 (小有名气)
|
[求助]
毕赤酵母表达问题求教
|
||||
| 使用载体pPIC9K整合表达，基因来源于细菌，根据序列预测的分子量为100 kDa左右，可是表达出来的蛋白大小在70 kDa左右，且不具备酶活，请问有可能哪些地方出现了问题？谢谢 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 酵母表达纯化一站式解决！ | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
266求调剂
已经有4人回复
-
324求调剂
已经有9人回复
-
招收生物学/细胞生物学调剂
已经有4人回复
-
一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。
已经有5人回复
-
284求调剂
已经有12人回复
-
348求调剂
已经有3人回复
-
329求调剂
已经有7人回复
-
求调剂，一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕
已经有4人回复
-
考研调剂
已经有9人回复
-
304材料求调剂
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 如何提高毕赤酵母的表达量
已经有12人回复
- 毕赤酵母ppic9k表达原理问题
已经有7人回复
- 求助毕赤酵母转化问题
已经有11人回复
- 请教关于毕赤酵母摇瓶发酵的问题
已经有8人回复
- 有关毕赤酵母表达
已经有3人回复
- 毕赤酵母表达时的杂蛋白问题
已经有16人回复
- smd1168毕赤酵母转化问题
已经有20人回复
- 毕赤酵母表达问题
已经有15人回复
- 外源蛋白在毕赤酵母中不表达
已经有18人回复
- 毕赤酵母表达蛋白纯化
已经有10人回复
- 毕赤酵母表达培养基
已经有4人回复
- 目的基因在毕赤酵母中的表达
已经有5人回复
- 毕赤酵母表达一直不表达
已经有13人回复
- 关于毕赤酵母表达载体
已经有16人回复
- 真题求教！！！
已经有10人回复
- Invitrogen 公司关于毕赤酵母表达系统的说明书
已经有205人回复
- 毕赤酵母发酵上清液——脱色素？？
已经有23人回复
- 【求助】药典中规定纯化水硝酸盐的检测方法出现问题了？？
已经有7人回复
- 【求助/交流】毕赤酵母表达用培养基BMGY BMMY的详细配制方法，请赐教。
已经有14人回复
- 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化
已经有22人回复
- 【求助/交流】推荐酿酒酵母、毕赤酵母胞内表达质粒
已经有10人回复
- 急！毕赤酵母表达问题
已经有8人回复
post_ngao
木虫 (正式写手)
科研宅
- BioEPI: 1
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 6362.9
- 红花: 1
- 帖子: 320
- 在线: 61.8小时
- 虫号: 1692067
- 注册: 2012-03-15
- 性别: GG
- 专业: 生物无机化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+50, BioEPI+1, 楼主奖励 2012-05-03 15:43:32
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+50, BioEPI+1, 楼主奖励 2012-05-03 15:43:32
|
第一，细菌来源的蛋白为什么要用酵母表达？原核蛋白用E coli就可以了啊。 第二，就算你要用毕赤酵母表达，那么你的原核来源基因是否经过优化？因为毕赤酵母中是存在非通用密码子的。 第三，分子量变小，第一时间必须果断测序，仔细检查是否存在移码突变、点突变等的问题，还必须考虑非通用密码子的问题。 第四，没有酶活力，除了序列的问题，我个人感觉还有使用毕赤酵母的原因。因为用酵母最多的就是在利用它的糖基化能力，而毕赤酵母的过糖基化是出了名的，并且N、O糖基化位点很难预测。你的蛋白是原核来源的，它在行使催化功能的时候是不需要糖基化的，如果给它强加入糖基化非常有可能堵住底物通道或者使得cap有位阻打不开，就属于多此一举了。 第五，同一个蛋白序列，用E coli和酵母分别表达时，其最终的折叠状态也是不同的，这也可能是没有活力的原因之一。 所知信息不多，只能大致说说，具体情况还得具体分析。有需要可以联系我。 |
3楼2012-05-03 10:16:36
post_ngao
木虫 (正式写手)
科研宅
- BioEPI: 1
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 6362.9
- 红花: 1
- 帖子: 320
- 在线: 61.8小时
- 虫号: 1692067
- 注册: 2012-03-15
- 性别: GG
- 专业: 生物无机化学
|
原始的毕赤酵母确实存在着蛋白酶，不过现在一般的工程菌都是蛋白酶敲除型的，你可以在网上查一下你的毕赤酵母的型号，比如GS-115等，就可以知道是否为蛋白酶敲除型的了。 另外我看你用的质粒是pPICZ9K，9K可以跨膜吗？貌似上面没有α-factor 的信号肽吧？没有的话就不会跨膜。如果你一定怀疑是蛋白酶的话，可以在培养基中加入蛋白酶抑制剂，比如最常用的PMSF. 我也曾经尝试过，对表达量影响不大，可以试一下。 PMSF：1)10mg/ml溶于异丙醇中; 在室温下可保存一年; 2)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 3)在水液体溶液中不稳定，必须在每一次分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 |
8楼2012-05-03 20:38:58
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liyouran85: 金币+50, ★有帮助, 5 2012-05-03 15:37:43
silicare: 金币-45, 楼主操作失误，补偿5个金币 2012-05-03 15:44:45
感谢参与，应助指数 +1
liyouran85: 金币+50, ★有帮助, 5 2012-05-03 15:37:43
silicare: 金币-45, 楼主操作失误，补偿5个金币 2012-05-03 15:44:45
|
本帖内容被屏蔽 |
2楼2012-05-02 23:17:49
liyouran85
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 690.9
- 红花: 3
- 帖子: 155
- 在线: 127小时
- 虫号: 487083
- 注册: 2007-12-28
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2012-05-03 16:05:09
liyouran85
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 690.9
- 红花: 3
- 帖子: 155
- 在线: 127小时
- 虫号: 487083
- 注册: 2007-12-28
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2012-05-03 16:06:39
danbomingyue
禁虫 (正式写手)
|
本帖内容被屏蔽 |
6楼2012-05-03 16:53:01
danbomingyue
禁虫 (正式写手)
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2012-05-03 16:57:37
feilinshiji
银虫 (小有名气)
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 336.9
- 红花: 2
- 帖子: 99
- 在线: 33.5小时
- 虫号: 1112545
- 注册: 2010-10-02
- 性别: GG
- 专业: 兽医免疫学
9楼2012-05-04 00:25:58
wurenzhi0721
铁虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1061.3
- 散金: 1400
- 红花: 10
- 沙发: 1
- 帖子: 976
- 在线: 201.6小时
- 虫号: 410035
- 注册: 2007-06-22
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
10楼2012-08-14 22:50:13
20