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liyouran85金虫 (小有名气)
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[求助]
毕赤酵母表达问题求教
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| 使用载体pPIC9K整合表达，基因来源于细菌，根据序列预测的分子量为100 kDa左右，可是表达出来的蛋白大小在70 kDa左右，且不具备酶活，请问有可能哪些地方出现了问题？谢谢 |
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post_ngao
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【答案】应助回帖
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silicare: 金币+50, BioEPI+1, 楼主奖励 2012-05-03 15:43:32
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silicare: 金币+50, BioEPI+1, 楼主奖励 2012-05-03 15:43:32
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第一，细菌来源的蛋白为什么要用酵母表达？原核蛋白用E coli就可以了啊。 第二，就算你要用毕赤酵母表达，那么你的原核来源基因是否经过优化？因为毕赤酵母中是存在非通用密码子的。 第三，分子量变小，第一时间必须果断测序，仔细检查是否存在移码突变、点突变等的问题，还必须考虑非通用密码子的问题。 第四，没有酶活力，除了序列的问题，我个人感觉还有使用毕赤酵母的原因。因为用酵母最多的就是在利用它的糖基化能力，而毕赤酵母的过糖基化是出了名的，并且N、O糖基化位点很难预测。你的蛋白是原核来源的，它在行使催化功能的时候是不需要糖基化的，如果给它强加入糖基化非常有可能堵住底物通道或者使得cap有位阻打不开，就属于多此一举了。 第五，同一个蛋白序列，用E coli和酵母分别表达时，其最终的折叠状态也是不同的，这也可能是没有活力的原因之一。 所知信息不多，只能大致说说，具体情况还得具体分析。有需要可以联系我。 |
3楼2012-05-03 10:16:36
post_ngao
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原始的毕赤酵母确实存在着蛋白酶，不过现在一般的工程菌都是蛋白酶敲除型的，你可以在网上查一下你的毕赤酵母的型号，比如GS-115等，就可以知道是否为蛋白酶敲除型的了。 另外我看你用的质粒是pPICZ9K，9K可以跨膜吗？貌似上面没有α-factor 的信号肽吧？没有的话就不会跨膜。如果你一定怀疑是蛋白酶的话，可以在培养基中加入蛋白酶抑制剂，比如最常用的PMSF. 我也曾经尝试过，对表达量影响不大，可以试一下。 PMSF：1)10mg/ml溶于异丙醇中; 在室温下可保存一年; 2)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 3)在水液体溶液中不稳定，必须在每一次分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 |
8楼2012-05-03 20:38:58
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2楼2012-05-02 23:17:49
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5楼2012-05-03 16:06:39
danbomingyue
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6楼2012-05-03 16:53:01
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7楼2012-05-03 16:57:37
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9楼2012-05-04 00:25:58
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