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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酵母表达，为什么表达不出来？
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

[求助] 酵母表达，为什么表达不出来？

最近做一个蛋白的毕赤酵母表达，具体过程如下：

A、将种子菌液20ul接种至5ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜。
B．取2.5ml至250ml BMGY培养基中（1%），30℃培养至OD600值5左右.
C、5000rpm离心5min，去上清，加入BMMY培养基重悬，使OD600等于1（实为0.89左右）.
D、30℃诱导培养，每隔24小时补加甲醇，使其终浓度为0.5%（我是以24小时甲醇全部消耗光来看的，所以补加0.5%的甲醇）。
E、30℃，诱导72h。
F、离心，取上清，补加适量缓冲后，0.45um过滤，纯化。

结果，GST纯化，纯化出来，只看到gst标签大小的蛋白，比目的蛋白小20多KD。

想问下大家，我的这个过程有没有什么问题？
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1楼 2011-06-27 10:31:31
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lihuaannie

新虫 (初入文坛)
没做过酵母的，但是原理应该差不多吧，看看你的GST后面是否带有终止子
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2楼2011-06-27 14:00:43
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693137546

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

snoopyzxx(金币+1): 上游确认过了，没有问题。我就想知道过程有没有问题。 2011-06-28 08:37:58
是不是上游出问题了
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大风气息云飞扬
3楼2011-06-27 22:58:27
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fjch2005

金虫 (小有名气)
★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-07-07 17:31:58
问题可能出在碳源上，在C步操作后，不能就开始加甲醇诱导，必须等待培养基中碳源（甘油之类）消耗完后，再加入甲醇，否则不能表达。
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4楼2011-07-07 15:34:20
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skpom

金虫 (小有名气)
你好，我也在做酵母表达，跑SDS-PAGE有目的条带大小的蛋白，但是测不出酶活，不知道怎么回事
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携手共创科技论坛
5楼2012-02-23 17:14:36
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啊Q精神

木虫 (小有名气)
培养条件需要优化的，培养的温度，pH ,甲醇浓度，溶氧 etc.蛋白是不是做下Western不就行了。还有蛋白降解的问题。
甲醇诱导的时候，可以加山梨醇作为碳源，不影响诱导。
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6楼2012-02-26 10:36:18
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