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runying36

银虫 (正式写手)

[求助] 外源蛋白在毕赤酵母中不表达

有哪位热心的战友给提示一下,我的外源蛋白在毕赤酵母中不表达,实验室同期做得都有表达,说明系统没有问题,但我的为什么没表达?有么有实战经验,一般这种情况先从哪方面试比较靠谱?
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runying36

银虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by luyongchao at 2013-11-05 11:42:14
电泳能看到条带吗,我的表达量也很低,只是WB的结果,他们说的方法我们都试过了,还是很低啊,怎么办怎么办!...

我目前也只是用WB检测出来的,但根据我们实验室的经验,曝光1分钟的阳性克隆就可以纯化出重组蛋白。我觉得你可以先不管SDS-page的结果,如果是需要重组蛋白就先纯化,如果只是拿粗提液做实验就直接做,不要浪费精力在不停地提高产量上。
9楼2013-11-05 15:48:29
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
runying36: 金币+1, 有帮助, 做了WB没检测到信号 2013-11-05 01:02:21
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-05 12:41:56
不表达还是表达量低,有没有做WB检测下;
如果是不表达:考虑目的基因有没有启动子;再就是考虑重组转化的问题了。
如果表达量低:可能是基因序列不适合毕赤酵母表达体系,可以考虑优化密码子;  或者体内体外构建多拷贝增加表达量,发酵条件的筛选也可以尝试
2楼2013-11-04 21:48:47
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
runying36: 金币+1, 有帮助, 做了WB没检测到信号,这样不知道优化这些方面会不会有实质性改变 2013-11-05 01:03:05
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-05 12:42:03
酵母表达影响因素很多:比较重要的考虑甲醇的量,诱导温度,诱导时间,接种量和酸碱度等,还有就是你的蛋白可能表达了,只是检测方法不当也不无可能,有标签的蛋白建议做WB;还有酵母表达有糖基化修饰,会导致实际蛋白大小比理论值要大一些。
爱拼才会赢
3楼2013-11-04 21:50:49
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaopeiliang at 2013-11-04 21:48:47
不表达还是表达量低,有没有做WB检测下;
如果是不表达:考虑目的基因有没有启动子;再就是考虑重组转化的问题了。
如果表达量低:可能是基因序列不适合毕赤酵母表达体系,可以考虑优化密码子;  或者体内体外构建 ...

拷贝数的增加并不一定能增加蛋白表达量,只是理论上有可能而已。
爱拼才会赢
4楼2013-11-04 21:52:36
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