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小科研女dow木虫 (小有名气)
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蛋白表达不出来，是什么原因造成的 已有1人参与
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各位虫友，我之前一直在做基因文库，好不容易从文库中筛到了具有我要的酶活性的克隆子。但是通过测序，是一条具有好几个阅读框的基因片段，但是发现并没有相似甚至相关的酶的基因，都是一些膜蛋白组件，还有几个是没有报道的未知蛋白，可是通过活性检测，明明是有活性的。 我的做法就是，将测序结果分析阅读框，挑了几个较大的阅读框（2000bp-500bp）都分别设计引物克隆表达，但是都做了4个了，都没有表达出蛋白，是一点都没有啊。 请问这是怎么回事？是不是不是所有的完整阅读框都能表达蛋白，只是有功能性的蛋白可以表达？ |
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 核酸生物学实验经验 | 实验技术、方法交流 |
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你是在原核细胞中表达？我先按照这个说，若不是你说出来，我在按照真核表达系统说。 克隆金银的表达，除了需要启动子外，还要Shine-Dalgarno Sequence (SD序列）。Shine-Dalgarno Sequence一般位于-10及翻译起始密码子ATG之间，是mRNA与16SrRNA结合时所必须。Shine-Dalgarno Sequence与翻译起始密码子ATG之间的距离会影响基因的表达。此距离的大小与不同的启动子有关，一般7-9个碱基。 |
2楼2013-06-20 21:53:35
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高效质粒载体表达外源基因的一般方法（原核表达系统）: （1）表达质粒的优化和设计：构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列 UAAGGAGG的翻译效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是6-8个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是5-7个碱基长度；ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3-4个碱基，与 AAGAA 至少相隔5 个碱基mRNA 的翻译才能进行；ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。其次，尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。再者，在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列。（2）共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因：由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。可采用1.通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子；2.在表达系统中共表达稀有密码子tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度。（3）提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌；对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达；共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因；对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造；在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。（4）高密度发酵和工程化宿主细胞：：大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。工程化宿主细胞：1.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌是解决高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用的根本途径。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值；用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断；改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。2.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因编码大肠杆RNA聚合酶的r32亚基，r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。 |
4楼2013-06-20 22:01:05
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-06-22 18:49:48
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克隆基因与表达基因时也要对coding sequence和coding region加以注意。 因为真核细胞中的翻译后加工过程肯定比原核生物要复杂很多，所以有些的出现在编码区的终止密码子在真核细胞中会得到纠正，但是在原核细胞中可能无法纠正，导致表达失败。所以在构建载体时应该尽量不要让真核基因的编码区的终止密码子存在，构架基因时就应该加以修订，改变非终止。可以用软件大致模拟一下要表达的蛋白质（如果已有天然构象就不用做了），大致知道编码区的终止密码子存在与蛋白质什么位置，如果知道天然蛋白质的氨基酸序列就直接改成成熟的蛋白质的此位点的氨基酸的密码子，如果不知道知道天然蛋白质的氨基酸序列就直接改成成熟的蛋白质的此位点的氨基酸那么就改为其同一条肽链的同种构象部分的相邻氨基酸残基的同属性的氨基酸的密码子。 另外，有时数据库给出的编码区，未必就是真的编码区，可能就是全基因序列，包括5’-UTR,3’-UTR,intron和exon。你适当的多差一些数据库和原始论文。因为不少人对coding sequence和coding region不同的理解。 关于编码区（cds）说明几点（给出具体文献！）----我早些时间回答的帖子（把内容合并到一起）： http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6010888 1.编码区（cds）就是指成熟mRNA的外显子（exon）区域，有些mRNA的前体切割下的内含子(intron)区域也可以编码，比如snoRNA就是用一些mRNA的内含子(intron)编码的，那种情况相对而言比较少见。 cds定义： http://www.answers.com/topic/coding-region “Oxford Dictionary of Biochemistry: coding region or coding sequence or coding sequence 1.(of a DNA molecule) an alternative name for exon. 2.(of a messenger RNA molecule) the portion of its complete nucleotide sequence that is translatable into polypeptide. It starts with the initiation codon AUG and ends with one of the termination codons UAA, UAG, or UGA.” Read more: http://www.answers.com/topic/coding-region#ixzz2WMqFAxT2 另见：B.Lewin,Genes IX,JONES AND BARTLETT PUBLISHERS,2008,P848: "A coding region is a part of the gene that represents a protein sequence." 2.不同的基因可能编码区域会有所重叠（即读码框不同），比如抗体的可变区的编码区。 3编码区（cds）内有时的确会有终止密码子存在，我就是说外显子序列，这时细胞（原核细胞、真核细胞都包括，还包括病毒侵入原核细胞、真核细胞后的病毒基因的翻译情况）的转录后水平和翻译可能会采取三种措施来消除终止密码子的翻译终止的作用：（1）RNA modification（原位改变碱基或者糖环）。（2）RNA editing（既有原位改变碱基又有插入或删除剪辑）。RNA modification与RNA editing的除改变位点外的其他区别在：RNA modification的种类比RNA editing要多很多；RNA editing可以插入和删除RNA的碱基----及改变RNA的碱基数量，RNA修饰不会；RNA editing的后果很多与翻译直接相关，RNA modification不强调这点。（3）Translational Hopping.翻译跳读，核糖体在翻译时有一段编码区不翻译直接跳过，并且可能造成以后的ORF的改变，比如T4噬菌体。（4）Recoding。比如特殊位置的UGA可以编码硒代半胱氨酸，Selenocysteine，这是改变密码子的原始含义；但是还有另外的情况：核糖体在翻译时发生编码框的移动，经常是以一个碱基的位置，并且可能造成以后的ORF的改变；最后核糖体翻译一个氨基酸而直接占用四个碱基并且造成以后的ORF的改变。 2与3参考文献： (1)B.Lewin,Genes IX,JONES AND BARTLETT PUBLISHERS,2008,P37-54; (2)M.B.Mathews,N.Sonenberg,J.W.B.Hershey edit,Translational Control in Biology and Medicine,Cold Spring Habor Laboratory Press,2007,,P625-654. 基因是包括内含子的！ 基因的定义： "A segment of a DNA molecule that contains the information required for the synthesis of a functional biological product,whether protein and RNA ,is referred to as gene." ------From David L.Nelson,Michael M.Cox,Lehinger Pricinples of Biochemistry, W.H.Freeman and Company, 2008,5th edition,P271. 数据库给出的完整的基因的碱基序列包括外显子、内含子、5’-UTR和3'UTR，如此完整的基因的碱基序列里含有多个终止子密码这不奇怪的；何况还没有考虑外显子在翻译水平和转录后水平的加工修饰去除掉外显子中的多余的终止密码子。 因为小木虫的帖子流动性非常大，所以我回答问题还是尽量完整，有些重复性内容有时候不可避免！  |
5楼2013-06-20 22:36:16
yanlinchun
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