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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

[求助] 请教:我的蛋白表达出来了,可溶,但为什么大部分都是没有活性的?

请教两个问题:我的蛋白是pEt系统的,带his标签,表达出来了在上清,也纯化出来了,目的蛋白浓度很高,但活性很差(当然表达条件我已经优化了:37度过夜),我就怀疑是不是表达出来的目的蛋白部分(应该是大部分,不是全部)失活了。我想请教的是,可能是哪些原因造成我的蛋白部分失活以及怎样改进呢?希望大家能帮我,谢谢!
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tigertang

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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zcf1990: 金币+1, 有帮助 2013-06-03 15:24:51
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-03 18:20:42
如果你的蛋白是真核生物来源的话,可能翻译后修饰或折叠对活性很重要,可以试试毕赤酵母或昆虫细胞等真核表达系统。
2楼2013-06-03 14:04:27
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yanfang2012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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zcf1990: 金币+1, 有帮助 2013-06-03 15:25:07
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2013-06-03 18:20:54
我的也是pET系统,带His标签,是原核蛋白,表达时用的25℃,还有你的蛋白会不会因为表达时被其他酶催化分解呢?所以你要注意温度,表达时有些操作要在冰上进行
believe yourself!
3楼2013-06-03 14:43:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


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你做的蛋白是否需要结合一定的辅助因子才有活性?
4楼2013-06-04 01:45:16
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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zcf1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-05 11:45:18
诱导温度太高了,蛋白失活了。15-25度合适。
5楼2013-06-04 08:46:12
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zcf1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-05 11:45:24
你是怎么检测你的蛋白活性的啊?按理说不会出现这种情况 还有你的是什么蛋白啊 你要是用western检测的话 western做不出条带原因很多 不能说明你蛋白失活
6楼2013-06-04 13:41:55
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 01:45:16
你做的蛋白是否需要结合一定的辅助因子才有活性?

辅助因子是二价铁,测活的时候加了。
7楼2013-06-04 17:18:05
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-06-04 08:46:12
诱导温度太高了,蛋白失活了。15-25度合适。

这个条件是参照文献上的,我试过低温的,几乎没有活性。
8楼2013-06-04 17:19:03
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-04 13:41:55
你是怎么检测你的蛋白活性的啊?按理说不会出现这种情况 还有你的是什么蛋白啊 你要是用western检测的话 western做不出条带原因很多 不能说明你蛋白失活

是按照文献报到的测活方法,“部分蛋白失活”是我的推断,并没有证实,因为除了这个可能我找不到其他的原因。
9楼2013-06-04 17:21:10
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-04 13:41:55
你是怎么检测你的蛋白活性的啊?按理说不会出现这种情况 还有你的是什么蛋白啊 你要是用western检测的话 western做不出条带原因很多 不能说明你蛋白失活

对了,我做的是HPPD,来源是拟南芥的。
10楼2013-06-04 17:21:47
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