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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教：我的蛋白表达出来了，可溶，但为什么大部分都是没有活性的?
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

[求助] 请教：我的蛋白表达出来了，可溶，但为什么大部分都是没有活性的?

请教两个问题：我的蛋白是pEt系统的，带his标签，表达出来了在上清，也纯化出来了，目的蛋白浓度很高，但活性很差（当然表达条件我已经优化了：37度过夜），我就怀疑是不是表达出来的目的蛋白部分（应该是大部分，不是全部）失活了。我想请教的是，可能是哪些原因造成我的蛋白部分失活以及怎样改进呢？希望大家能帮我，谢谢！
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1楼 2013-06-03 10:40:22
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tigertang

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zcf1990: 金币+1, ★有帮助 2013-06-03 15:24:51
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-03 18:20:42
如果你的蛋白是真核生物来源的话，可能翻译后修饰或折叠对活性很重要，可以试试毕赤酵母或昆虫细胞等真核表达系统。
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2楼2013-06-03 14:04:27
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yanfang2012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zcf1990: 金币+1, ★有帮助 2013-06-03 15:25:07
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-06-03 18:20:54
我的也是pET系统，带His标签，是原核蛋白，表达时用的25℃，还有你的蛋白会不会因为表达时被其他酶催化分解呢？所以你要注意温度，表达时有些操作要在冰上进行
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believe yourself！
3楼2013-06-03 14:43:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
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zcf1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-05 11:45:13
你做的蛋白是否需要结合一定的辅助因子才有活性？
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4楼2013-06-04 01:45:16
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zcf1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-05 11:45:18
诱导温度太高了，蛋白失活了。15-25度合适。
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5楼2013-06-04 08:46:12
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zcf1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-05 11:45:24
你是怎么检测你的蛋白活性的啊？按理说不会出现这种情况 还有你的是什么蛋白啊 你要是用western检测的话 western做不出条带原因很多 不能说明你蛋白失活
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6楼2013-06-04 13:41:55
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-04 01:45:16
你做的蛋白是否需要结合一定的辅助因子才有活性？

辅助因子是二价铁，测活的时候加了。
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7楼2013-06-04 17:18:05
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-06-04 08:46:12
诱导温度太高了，蛋白失活了。15-25度合适。

这个条件是参照文献上的，我试过低温的，几乎没有活性。
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8楼2013-06-04 17:19:03
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-04 13:41:55
你是怎么检测你的蛋白活性的啊？按理说不会出现这种情况 还有你的是什么蛋白啊 你要是用western检测的话 western做不出条带原因很多 不能说明你蛋白失活

是按照文献报到的测活方法，“部分蛋白失活”是我的推断，并没有证实，因为除了这个可能我找不到其他的原因。
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9楼2013-06-04 17:21:10
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-04 13:41:55
你是怎么检测你的蛋白活性的啊？按理说不会出现这种情况 还有你的是什么蛋白啊 你要是用western检测的话 western做不出条带原因很多 不能说明你蛋白失活

对了，我做的是HPPD，来源是拟南芥的。
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10楼2013-06-04 17:21:47
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