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[交流]
请教高手：转有pACYCDuet-1和pETDuet-1双载体四基因的共表达问题
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请教高手：我现在做四个基因的共表达，使用的是双表达载体pACYCDuet-1和pETDuet-1，但活性没有预期的高。遇到了一系列问题，希望大家可以提供宝贵的经验和建议： （1)如何进行IPTG的诱导？我现在方法如下：活化过夜，转接100ml LB培养基，培养至OD=0.7-0.8，加终浓度0.5mM的IPTG诱导，25度诱导5h左右。超声破碎，得粗酶液，加底物孵育24h。这样有没有问题啊？有哪位高手做过类似的实验？希望提供点建议？ （2）我想要的蛋白是细菌中的可溶性蛋白，因为我的酶需要四个基因，所以纯化不太现实。所以使用细菌破碎液。我收集菌体，超声破碎，用的功率300w，3s超声，3s间隙，10-20分钟。这样破碎会有有问题？大家普遍的建议是菌体变澄清就可以了，但是稍微透明就好，还是变得完全透明。文献中的透明一直没搞明白？？？？？ 希望大家可以提供宝贵的经验和建议 |
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