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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教高手：转有pACYCDuet-1和pETDuet-1双载体四基因的共表达问题
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)

[交流] 请教高手：转有pACYCDuet-1和pETDuet-1双载体四基因的共表达问题

请教高手：我现在做四个基因的共表达，使用的是双表达载体pACYCDuet-1和pETDuet-1，但活性没有预期的高。遇到了一系列问题，希望大家可以提供宝贵的经验和建议：
（1)如何进行IPTG的诱导？我现在方法如下：活化过夜，转接100ml LB培养基，培养至OD=0.7-0.8，加终浓度0.5mM的IPTG诱导，25度诱导5h左右。超声破碎，得粗酶液，加底物孵育24h。这样有没有问题啊？有哪位高手做过类似的实验？希望提供点建议？
（2）我想要的蛋白是细菌中的可溶性蛋白，因为我的酶需要四个基因，所以纯化不太现实。所以使用细菌破碎液。我收集菌体，超声破碎，用的功率300w，3s超声，3s间隙，10-20分钟。这样破碎会有有问题？大家普遍的建议是菌体变澄清就可以了，但是稍微透明就好，还是变得完全透明。文献中的透明一直没搞明白？？？？？
希望大家可以提供宝贵的经验和建议
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1楼 2012-12-04 12:53:12
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
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最体外酶催化用不上共表达吧，还是四个基因的，分别表达纯化后，再将酶放一起催化不行吗？
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2楼2012-12-04 14:39:09
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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qingtingzhe: 金币+2 2012-12-08 18:37:59
至少跑个电泳看下你的四个蛋白是否都表达吧..
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3楼2012-12-06 11:30:35
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严春秋

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
qingtingzhe: 金币+5 2012-12-08 18:31:47
最体外酶催化用不上共表达吧，还是四个基因的，分别表达纯化后，再将酶放一起催化不行吗？
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7楼2012-12-06 13:00:19
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 严春秋 at 2012-12-06 13:00:19
最体外酶催化用不上共表达吧，还是四个基因的，分别表达纯化后，再将酶放一起催化不行吗？

底物为大分子物质没法进入细胞，所以要破碎用粗酶液。有些蛋白比较脆弱，在纯化的过程中就失活了，特别是保证四个蛋白同时有活性很难。所以无法纯化！谢谢参与
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9楼2012-12-08 18:31:27
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qingtingzhe

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-12-06 11:30:35
至少跑个电泳看下你的四个蛋白是否都表达吧..

跑过，有些蛋白过量表达，有些不确定，因为蛋白条带太多，所以很难确定四个蛋白表达量如何。
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10楼2012-12-08 18:35:33
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albert75284楼
2012-12-06 12:16   回复  
su-b085楼
2012-12-06 12:34   回复  
woshilaoaa6楼
2012-12-06 12:50   回复  
hatudi8楼
2012-12-06 13:36   回复  
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