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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 膜蛋白表达问题
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101202139

铜虫 (小有名气)

[求助] 膜蛋白表达问题

我最近在做原核生物的膜蛋白在大肠杆菌中的表达，大致是将目的基因克隆到pET-30a的表达载体上，然后转化到BL21-DE3的感受态细胞中，诱导表达，通过SDS-PAGE电泳，观察结果。可是现在的问题是根本就没有目的蛋白条带，所以求有经验的虫友们不吝赐教。不胜感激……
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1楼 2011-07-25 13:06:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

vivi625

金虫 (初入文坛)
★ ★
dhd997(金币+2): 安慰一下，继续努力 2011-07-30 13:22:00
我之前做的也是表达不出蛋白，貌似和楼主的一样，前面做的都没什么问题，测序的结果也正常，可是就是跑SDS-PAGE的时候没有我想的条带.....悲催的...
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9楼2011-07-27 10:35:18
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莫名Zoe

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 第一帖，欢迎多来交流哦 2011-08-04 13:17:42
我也是这个问题……一样的载体，克隆都成了，但是就是蛋白表达不成
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10楼2011-08-03 22:46:38
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普通回帖

gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金币+4): 2011-07-25 20:13:40
正在做这方面实验，你的情况说的不是很清楚。
1，通过别的手段鉴定是否表达，如构建的克隆基因有某方面功能可以直接用于筛选。我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~
2，菌体PCR或者提质粒PCR验证，提质粒酶切验证。
3，测序。
把前期工作做好，然后开始诱导表达。
4，蛋白电泳
    诱导浓度：IPTG诱导过夜诱导，浓度0.5mM，37℃，在加IPTG诱导的同时加0.1M的底物增大选择压力。
5，离心除去菌液上清，加PBS，菌体超声破碎，一部分离心分为破碎上清和沉淀，一部分跑全蛋白。理论上膜蛋白跑全蛋白就行。
6，优化诱导条件。括温度、时间等。你可以搜索一下论坛，很多这方面的帖子。
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2楼2011-07-25 16:52:24
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-25 20:42:57
如果37℃过夜都不表达，其他温度诱导也不会太理想吧？~
膜蛋白做起来难啊。

这是pET手册的内容：
温度
37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白(Schein and Noteborn, 1989)。如果你打算利用一些pET 载体中的信号肽序列输出蛋白的话，在25℃或30℃生长和培养可能是最优化的。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
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3楼2011-07-25 19:40:39
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101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-25 16:52:24:
正在做这方面实验，你的情况说的不是很清楚。
1，通过别的手段鉴定是否表达，如构建的克隆基因有某方面功能可以直接用于筛选。我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~
...

首先，克隆肯定是没有问题的。酶切验证过，而且也测过序列，完全正确。
其次，在诱导表达蛋白时，我的膜蛋白A大小是37.5KD，跑SDS-PAGE，发现有差不多大小的蛋白，另外我又做了膜蛋白B的表达（目的大小是53.1ＫＤ），跑SDS-PAGE，没有目的条带，而且发现膜蛋白A的胶图与膜蛋白B的胶图很类似。所以很有可能是我的表达系统的问题，下一步就选择一种普通的蛋白作为对照，发现膜蛋白A的目的大小条带也在普通蛋白胶图上。总而言之，膜蛋白A、膜蛋白B在表达宿主菌中均没有表达。不知道是什么情况？
最后，你说的“我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~”这句话没有太明白。我的目的基因没有某方面的功能。
本人是新手，还望多多指点……
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4楼2011-07-25 20:13:03
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101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-25 19:40:39:
如果37℃过夜都不表达，其他温度诱导也不会太理想吧？~
膜蛋白做起来难啊。

这是pET手册的内容：
温度
37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白(Schein and Not ...

现在的问题不是蛋白有没有可溶性的问题，而是蛋白有没有表达的问题。
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5楼2011-07-25 20:17:28
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ztiger

金虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 可以说的详细一下？ 2011-07-30 13:21:04
有些膜蛋白确实无法表达，你加上增加可溶性的标签蛋白试一下。
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6楼2011-07-25 21:55:16
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 很有条理，再次奖励！ 2011-07-25 23:27:35
就是从得到该基因，克隆至载体，转化大肠杆菌TransT1，提质粒再次转化目的菌株，然后做抗性梯度验证这个过程。
我做的是某氨基酸输出蛋白，是一种膜蛋白，约200aa，抗性梯度很漂亮，涉及专利。因为表达这个输出蛋白，肯定会引起菌体对该氨基酸有较大抗性，所以使用含有不同浓度该氨基酸的平板验证是否有抗性。我已经验证出2个基因了。
还是有些问题的。
1，如果某一个pET不表达，一系列的pET可能都不表达，有些人这么认为，我没有经历过，供你参考。为什么pET不表达，这个。。。好难啊，我也不知道。
2，膜蛋白确定可以表达？某些基因难表达，或不表达~我去，这个，有点难以接受啊，有相关资料吗？可以查一下。
3，原核生物的膜蛋白合不合适BL21表达。
如果是上述原因，建议换基因，换载体。
4，得到蛋白质序列，做密码子优化。这一步或许可以解决很多问题。因为某原核膜蛋白密码子肯定不同于大肠杆菌密码子，我做的这个膜蛋白是通过基因合成的方式得到的：NCBI得到蛋白质序列——根据宿主（大肠杆菌）优化密码子（优化后的密码子NCBI比对跟原核酸序列没有任何相关性）——克隆表达，有用rosetta（de3菌株）的，可以表达稀有密码子。
5，western blot 看是不是真的木有表达。
6，有木有异源信号肽？膜蛋白信号肽可能影响表达。
7，有木有可能是二聚体或多聚体，你再看看？
8，突变造成的终止或不表达，pET载体突变造成的不表达也不能排除（转化到pET后测序正确可以排除这个）。
9，优化各种条件，甚至包括培养条件，摇床转速，诱导时间，诱导温度。

纠结的膜蛋白~
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7楼2011-07-25 23:05:37
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darwinxie

铁杆木虫 (职业作家)

自强瓜族族长-----呆瓜大叔
★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎多来交流哦 2011-07-30 13:21:34
直接订个膜蛋白纯化kit就可以了
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一切都会好的，雨后的天空更加明朗！人生苦短，快乐至上，加油！
8楼2011-07-26 09:25:59
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