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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PICZaA在GS115内表达跨膜蛋白
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pidou213

木虫 (正式写手)

[求助] PICZaA在GS115内表达跨膜蛋白

1，PICZaA在GS115内的分泌表达后，上清主要有什么蛋白？一般在多大KD的？
2，PICZaA在GS115内表达跨膜蛋白的时候，跨膜蛋白的跨膜区需要处理掉吗？
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见得多爱的多
1楼2011-04-28 17:16:07
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 高手高高手 2011-04-28 19:00:40
pidou213(金币+1): 还是应该感谢一下 2011-04-29 08:37:10
pidou213(金币+1): 讲的有道理 2011-05-10 12:31:38
pidou213(金币+1): 再加一个 2011-07-01 12:30:35
pidou213(金币+2): xx 2011-07-17 16:24:06
1.这个应该需要通过跑PAGE来确定。
2.最好除掉，因为分泌用的是PICZaA上的a factor。不切掉跨膜区，表达时，酵母不一定能够正确的去剪切。
如果我做，估计得切跨膜区做一个，不切做一个。做个对照，因为最终酶活最能说明问题。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-04-28 17:54:51
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-04-28 17:54:51:
1.这个应该需要通过跑PAGE来确定。
2.最好除掉，因为分泌用的是PICZaA上的a factor。不切掉跨膜区，表达时，酵母不一定能够正确的去剪切。
如果我做，估计得切跨膜区做一个，不切做一个。做个对照，因为最终酶活 ...

首先感谢你的回复，但是我想说的是，我之所以求助，就是因为我不确定，所以想找人来指导一下，结果你说了半天都是拿不定的答案，并且你也知道，做这个酵母表达很麻烦的，如果我自己有时间试一试的话，我还来求助做什么呢
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见得多爱的多
3楼2011-04-29 08:36:24
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-04-28 17:54:51:
1.这个应该需要通过跑PAGE来确定。
2.最好除掉，因为分泌用的是PICZaA上的a factor。不切掉跨膜区，表达时，酵母不一定能够正确的去剪切。
如果我做，估计得切跨膜区做一个，不切做一个。做个对照，因为最终酶活 ...

1.这个应该需要通过跑PAGE来确定

这个问题，我的意思是想问问做过的人，拿张图或者根据自己的所知来回答，结果你说用PAGE胶来确定，你实在是太实在了，我相信做蛋白的就知道用PAGE来确定蛋白的吧？@
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4楼2011-04-29 08:38:56
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
1949stone(金币+3): 鼓励 2011-05-03 21:09:41
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Originally posted by pidou213 at 2011-04-29 08:36:24:
首先感谢你的回复，但是我想说的是，我之所以求助，就是因为我不确定，所以想找人来指导一下，结果你说了半天都是拿不定的答案，并且你也知道，做这个酵母表达很麻烦的，如果我自己有时间试一试的话，我还来求 ...

酵母表达很烦吗？我从质粒构建到整合到表达到纯化，一共化了两个星期。
不是我让你试，是你的蛋白要想做出最优的表达，是不得不试，你看些综述就知道了。
做实验本来就是纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行的。
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Thank-you，so-blue.
5楼2011-04-30 11:09:26
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-04-30 11:09:26:
酵母表达很烦吗？我从质粒构建到整合到表达到纯化，一共化了两个星期。
不是我让你试，是你的蛋白要想做出最优的表达，是不得不试，你看些综述就知道了。
做实验本来就是纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行的。

我从质粒构建到整合到表达到纯化，一共化了两个星期。


我真的很佩服你 对不起，碰上高手了

但是据我所知，载体构建后需要测序验证，然后转化后 酵母需要培养2-3天才能长出。然后你还要再次确定是否转化进去了（——也就是说是否是假阳性），然后诱导表达 需要至少鉴定四天的 再然后 做Western 至少一天才能出结果把？

两个星期 我实在佩服
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6楼2011-04-30 18:32:09
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-03 21:09:57
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Originally posted by pidou213 at 2011-04-30 18:32:09:
我从质粒构建到整合到表达到纯化，一共化了两个星期。


我真的很佩服你 对不起，碰上高手了

但是据我所知，载体构建后需要测序验证，然后转化后 酵母需要培养2-3天才能长出。然后你还要再次确定是否转化 ...

做的顺手的话，中间不出什么问题
e.coli大约也就只要一周时间左右呗，酵母费劲点，长的慢些，但也要不了太久。

当然中间不出问题，不需要优化…要是有问题了，那可能两年也做不出来
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7楼2011-04-30 23:22:09
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pidou213

木虫 (正式写手)
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Originally posted by roomofxw at 2011-04-30 23:22:09:
做的顺手的话，中间不出什么问题
e.coli大约也就只要一周时间左右呗，酵母费劲点，长的慢些，但也要不了太久。

当然中间不出问题，不需要优化…要是有问题了，那可能两年也做不出来

好吧 总的来说 还是感谢你的答复 真希望在现实中有这么一个诤友，或许实验就会快很多，进步会快很多，哈哈 你在哪个城市？
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8楼2011-05-01 09:12:40
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-05-01 09:12:40:
好吧 总的来说 还是感谢你的答复 真希望在现实中有这么一个诤友，或许实验就会快很多，进步会快很多，哈哈 你在哪个城市？

北京
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9楼2011-05-02 21:06:42
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-05-02 21:06:42:
北京

不会是中国农业大学的吧？
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10楼2011-05-02 22:42:01
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