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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来
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无情草

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来

我刚刚开始做膜蛋白（氨基酸转运蛋白）的表达，该膜蛋白是个5次跨膜的蛋白，按理说原核的应该比真核的好表达一点，但之前先用pET28a表达载体宿主BL21做过，后来又做了融合表达（谷胱甘肽标签）还是一点不表达，测序结果表明基因序列没问题，不知道哪里出了问题，跪求高手指导，感激不尽！
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最初的梦想
1楼 2010-10-25 21:07:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

幸福常在

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也是做跨膜蛋白，具七次跨膜结构，用过PET28a载体分别转过BL21（DE3）和具有稀有密码子的transset（DE3)宿主,同时做过两遍的时间诱导（2h，4h，6h）和浓度诱导（0.2,0.6,1.0,1.4的IPTG），同时做是其他基因完美诱导出来了，就是这个具有跨膜结构的一直SDS-PAGE无条带，现在转换PET32a载体转BL21（de3），但是一直连接不上，目前原核表达已经耗时近2个月共8次了，甚为纠结，含泪求各位战友指教！！！
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11楼2012-04-09 09:41:12
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普通回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
无情草(金币+2): 2010-10-26 10:37:43
看你的意思是你的蛋白源自原核生物，理论上说在原核中表达是比真核膜蛋白在原核中表达要容易。

但是你这里仍然存在几个问题：
1，你是否只试了一个载体，一个宿主？我们手头上有一个真核基因，在大肠中表达的时候筛遍了宿主，最后只在Rosetta gami中表达，而且必须加去垢剂才能溶解。
2，你最后跑SDS-PAGE检测的时候应该是whole cell lysate 吧，煮沸变性了么？

我的直觉是：
你首先可以（必须）筛选宿主，多转化几种宿主细胞看看。或者换标签，GST标签不行，说不定His就可以的例子也是有的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-10-25 21:23:07
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩
无情草(金币+1): 2010-10-26 10:37:51
呵呵，同意楼上的说法，只试了一个载体一个宿主菌不表达比较正常啊，楼主多试试吧。。。宿主菌和载体都可以尝试换不同的。。
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2010-10-25 21:48:42
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无情草

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-10-25 21:23:07:
看你的意思是你的蛋白源自原核生物，理论上说在原核中表达是比真核膜蛋白在原核中表达要容易。

但是你这里仍然存在几个问题：
1，你是否只试了一个载体，一个宿主？我们手头上有一个真核基因，在大肠中表达的 ...

多谢指教，我确实是煮沸全细胞裂解的取的上清加样的，但是没有使用去垢剂溶解，请问是用去垢剂溶解沉淀蛋白吗？
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最初的梦想
4楼2010-10-26 10:43:22
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无情草

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by foryever at 2010-10-25 21:48:42:
呵呵，同意楼上的说法，只试了一个载体一个宿主菌不表达比较正常啊，楼主多试试吧。。。宿主菌和载体都可以尝试换不同的。。

多谢了，我会的
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最初的梦想
5楼2010-10-26 10:44:10
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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无情草(金币+1): 2010-10-26 17:14:51
引用回帖:
Originally posted by 无情草 at 2010-10-26 10:43:22:

多谢指教，我确实是煮沸全细胞裂解的取的上清加样的，但是没有使用去垢剂溶解，请问是用去垢剂溶解沉淀蛋白吗？

不是的，我就怕你没有煮沸就跑SDS-PAGE了，既然煮了那就证明确实是没有表达。尝试换宿主和载体吧，这个是最简单有效的手段了。
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6楼2010-10-26 13:14:10
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virus2009

金虫 (正式写手)

人称 龙哥
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 16:35:34
无情草(金币+1): 2010-10-26 17:15:32
膜蛋白不是那么好提取的，特别是多次跨膜蛋白，加入去污剂的话，不利于对蛋白的下游研究。建议提取跨膜蛋白的试剂盒，TM-PEK，默克公司产品!
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virus
7楼2010-10-26 14:04:04
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无情草

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by virus2009 at 2010-10-26 14:04:04:
膜蛋白不是那么好提取的，特别是多次跨膜蛋白，加入去污剂的话，不利于对蛋白的下游研究。建议提取跨膜蛋白的试剂盒，TM-PEK，默克公司产品!

谢谢，我不做膜蛋白提取，只是基因功能验证
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最初的梦想
8楼2010-10-26 17:17:05
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无情草

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-10-26 13:14:10:



不是的，我就怕你没有煮沸就跑SDS-PAGE了，既然煮了那就证明确实是没有表达。尝试换宿主和载体吧，这个是最简单有效的手段了。

你好，我又尝试了Rosetta宿主，结果还是不理想，我在想是不是表达量很低，检测方法灵敏度不足以检测到，目前还在纠结中
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最初的梦想
9楼2010-11-07 20:15:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
无情草(金币+3): 2010-11-10 16:43:33
引用回帖:
Originally posted by 无情草 at 2010-11-07 20:15:32:


你好，我又尝试了Rosetta宿主，结果还是不理想，我在想是不是表达量很低，检测方法灵敏度不足以检测到，目前还在纠结中

我觉得你试的宿主还是太少了，将能利用到的宿主都筛一遍，这个应该比筛载体要简单许多的。当宿主筛选完毕后，还没有表达量很高的，就可以考虑筛载体了。

如果你跑SDS-PAGE，全细胞裂解还看不到产物的话只能证明表达量极低，甚至根本没有表达，因为SDS-PAGE的检测限是ng级别的。

可能你们实验室不专门做这块儿，你觉得会有点困难。呵呵，坚持一下吧，多试一下也许就出来了呢，生物实验基本上都是这样的，一帆风顺的时候极少。
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10楼2010-11-07 21:47:54
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