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无情草

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来

我刚刚开始做膜蛋白（氨基酸转运蛋白）的表达，该膜蛋白是个5次跨膜的蛋白，按理说原核的应该比真核的好表达一点，但之前先用pET28a表达载体宿主BL21做过，后来又做了融合表达（谷胱甘肽标签）还是一点不表达，测序结果表明基因序列没问题，不知道哪里出了问题，跪求高手指导，感激不尽！
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最初的梦想
1楼 2010-10-25 21:07:56
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
无情草(金币+3): 2010-11-10 16:43:33
引用回帖:
Originally posted by 无情草 at 2010-11-07 20:15:32:


你好，我又尝试了Rosetta宿主，结果还是不理想，我在想是不是表达量很低，检测方法灵敏度不足以检测到，目前还在纠结中

我觉得你试的宿主还是太少了，将能利用到的宿主都筛一遍，这个应该比筛载体要简单许多的。当宿主筛选完毕后，还没有表达量很高的，就可以考虑筛载体了。

如果你跑SDS-PAGE，全细胞裂解还看不到产物的话只能证明表达量极低，甚至根本没有表达，因为SDS-PAGE的检测限是ng级别的。

可能你们实验室不专门做这块儿，你觉得会有点困难。呵呵，坚持一下吧，多试一下也许就出来了呢，生物实验基本上都是这样的，一帆风顺的时候极少。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
10楼2010-11-07 21:47:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
无情草(金币+2): 2010-10-26 10:37:43
看你的意思是你的蛋白源自原核生物，理论上说在原核中表达是比真核膜蛋白在原核中表达要容易。

但是你这里仍然存在几个问题：
1，你是否只试了一个载体，一个宿主？我们手头上有一个真核基因，在大肠中表达的时候筛遍了宿主，最后只在Rosetta gami中表达，而且必须加去垢剂才能溶解。
2，你最后跑SDS-PAGE检测的时候应该是whole cell lysate 吧，煮沸变性了么？

我的直觉是：
你首先可以（必须）筛选宿主，多转化几种宿主细胞看看。或者换标签，GST标签不行，说不定His就可以的例子也是有的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-10-25 21:23:07
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩
无情草(金币+1): 2010-10-26 10:37:51
呵呵，同意楼上的说法，只试了一个载体一个宿主菌不表达比较正常啊，楼主多试试吧。。。宿主菌和载体都可以尝试换不同的。。
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2010-10-25 21:48:42
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无情草

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-10-25 21:23:07:
看你的意思是你的蛋白源自原核生物，理论上说在原核中表达是比真核膜蛋白在原核中表达要容易。

但是你这里仍然存在几个问题：
1，你是否只试了一个载体，一个宿主？我们手头上有一个真核基因，在大肠中表达的 ...

多谢指教，我确实是煮沸全细胞裂解的取的上清加样的，但是没有使用去垢剂溶解，请问是用去垢剂溶解沉淀蛋白吗？
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最初的梦想
4楼2010-10-26 10:43:22
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