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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来
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无情草

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来

我刚刚开始做膜蛋白（氨基酸转运蛋白）的表达，该膜蛋白是个5次跨膜的蛋白，按理说原核的应该比真核的好表达一点，但之前先用pET28a表达载体宿主BL21做过，后来又做了融合表达（谷胱甘肽标签）还是一点不表达，测序结果表明基因序列没问题，不知道哪里出了问题，跪求高手指导，感激不尽！
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最初的梦想
1楼 2010-10-25 21:07:56
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
无情草(金币+1): 2010-10-26 17:14:51
引用回帖:
Originally posted by 无情草 at 2010-10-26 10:43:22:

多谢指教，我确实是煮沸全细胞裂解的取的上清加样的，但是没有使用去垢剂溶解，请问是用去垢剂溶解沉淀蛋白吗？

不是的，我就怕你没有煮沸就跑SDS-PAGE了，既然煮了那就证明确实是没有表达。尝试换宿主和载体吧，这个是最简单有效的手段了。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
6楼2010-10-26 13:14:10
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
无情草(金币+2): 2010-10-26 10:37:43
看你的意思是你的蛋白源自原核生物，理论上说在原核中表达是比真核膜蛋白在原核中表达要容易。

但是你这里仍然存在几个问题：
1，你是否只试了一个载体，一个宿主？我们手头上有一个真核基因，在大肠中表达的时候筛遍了宿主，最后只在Rosetta gami中表达，而且必须加去垢剂才能溶解。
2，你最后跑SDS-PAGE检测的时候应该是whole cell lysate 吧，煮沸变性了么？

我的直觉是：
你首先可以（必须）筛选宿主，多转化几种宿主细胞看看。或者换标签，GST标签不行，说不定His就可以的例子也是有的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-10-25 21:23:07
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩
无情草(金币+1): 2010-10-26 10:37:51
呵呵，同意楼上的说法，只试了一个载体一个宿主菌不表达比较正常啊，楼主多试试吧。。。宿主菌和载体都可以尝试换不同的。。
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2010-10-25 21:48:42
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无情草

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-10-25 21:23:07:
看你的意思是你的蛋白源自原核生物，理论上说在原核中表达是比真核膜蛋白在原核中表达要容易。

但是你这里仍然存在几个问题：
1，你是否只试了一个载体，一个宿主？我们手头上有一个真核基因，在大肠中表达的 ...

多谢指教，我确实是煮沸全细胞裂解的取的上清加样的，但是没有使用去垢剂溶解，请问是用去垢剂溶解沉淀蛋白吗？
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最初的梦想
4楼2010-10-26 10:43:22
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