应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 膜蛋白表达问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 4544  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

101202139

铜虫 (小有名气)

[求助] 膜蛋白表达问题

我最近在做原核生物的膜蛋白在大肠杆菌中的表达，大致是将目的基因克隆到pET-30a的表达载体上，然后转化到BL21-DE3的感受态细胞中，诱导表达，通过SDS-PAGE电泳，观察结果。可是现在的问题是根本就没有目的蛋白条带，所以求有经验的虫友们不吝赐教。不胜感激……
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-07-25 13:06:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-25 20:42:57
如果37℃过夜都不表达，其他温度诱导也不会太理想吧？~
膜蛋白做起来难啊。

这是pET手册的内容：
温度
37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白(Schein and Noteborn, 1989)。如果你打算利用一些pET 载体中的信号肽序列输出蛋白的话，在25℃或30℃生长和培养可能是最优化的。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-07-25 19:40:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金币+4): 2011-07-25 20:13:40
正在做这方面实验，你的情况说的不是很清楚。
1，通过别的手段鉴定是否表达，如构建的克隆基因有某方面功能可以直接用于筛选。我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~
2，菌体PCR或者提质粒PCR验证，提质粒酶切验证。
3，测序。
把前期工作做好，然后开始诱导表达。
4，蛋白电泳
    诱导浓度：IPTG诱导过夜诱导，浓度0.5mM，37℃，在加IPTG诱导的同时加0.1M的底物增大选择压力。
5，离心除去菌液上清，加PBS，菌体超声破碎，一部分离心分为破碎上清和沉淀，一部分跑全蛋白。理论上膜蛋白跑全蛋白就行。
6，优化诱导条件。括温度、时间等。你可以搜索一下论坛，很多这方面的帖子。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-07-25 16:52:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-25 16:52:24:
正在做这方面实验，你的情况说的不是很清楚。
1，通过别的手段鉴定是否表达，如构建的克隆基因有某方面功能可以直接用于筛选。我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~
...

首先，克隆肯定是没有问题的。酶切验证过，而且也测过序列，完全正确。
其次，在诱导表达蛋白时，我的膜蛋白A大小是37.5KD，跑SDS-PAGE，发现有差不多大小的蛋白，另外我又做了膜蛋白B的表达（目的大小是53.1ＫＤ），跑SDS-PAGE，没有目的条带，而且发现膜蛋白A的胶图与膜蛋白B的胶图很类似。所以很有可能是我的表达系统的问题，下一步就选择一种普通的蛋白作为对照，发现膜蛋白A的目的大小条带也在普通蛋白胶图上。总而言之，膜蛋白A、膜蛋白B在表达宿主菌中均没有表达。不知道是什么情况？
最后，你说的“我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~”这句话没有太明白。我的目的基因没有某方面的功能。
本人是新手，还望多多指点……
赞一下 回复此楼
4楼2011-07-25 20:13:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-25 19:40:39:
如果37℃过夜都不表达，其他温度诱导也不会太理想吧？~
膜蛋白做起来难啊。

这是pET手册的内容：
温度
37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白(Schein and Not ...

现在的问题不是蛋白有没有可溶性的问题，而是蛋白有没有表达的问题。
赞一下 回复此楼
5楼2011-07-25 20:17:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 调剂 +5 好好读书。 2026-04-01 5/250 2026-04-05 17:54 by liucky
[考研] 086000生物与医药298调剂求助 +8 元元青青 2026-03-31 10/500 2026-04-05 17:44 by Ecowxq666！
[考研] 270分求调剂 +4 maxjxbsk 2026-04-01 4/200 2026-04-05 17:04 by yulian1987
[考研] 288求调剂 +7 没有答案_ 2026-04-05 7/350 2026-04-05 17:01 by yulian1987
[考研] 323求调剂（计算机视觉和大模型项目经历） +3 chaoxiicy 2026-03-31 3/150 2026-04-05 10:33 by zhq0425
[考研] 一志愿北京化工大学，初试成绩350求调剂 +9 沿岸?贝壳 2026-04-04 14/700 2026-04-05 01:09 by 沿岸?贝壳
[考研] 296材料专硕求调剂 +21 202451007219 2026-04-02 22/1100 2026-04-04 21:48 by hemengdong
[考研] 一志愿上海大学生物学346 +3 上海大学346调剂 2026-04-03 3/150 2026-04-04 20:20 by dongzh2009
[考研] 368求调剂 +5 今华习 2026-04-03 7/350 2026-04-04 18:47 by imissbao
[考研] 281求调剂 +10 aaawhy 2026-04-03 10/500 2026-04-03 21:42 by lbsjt
[考研] 320求调剂 +3 农业工程与信息� 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:40 by 土木硕士招生
[考研] 一志愿安徽大学0817化学工程与技术，求调剂 +14 我不是只因 2026-04-02 15/750 2026-04-03 09:49 by 蓝云思雨
[考博] 申博求助 +3 Reee1Llll 2026-04-01 3/150 2026-04-02 22:29 by 这是一个无聊的�
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
[考研] 一志愿9初试366 本双非求调剂 +4 运气来得若有似� 2026-04-02 4/200 2026-04-02 09:56 by guanxin1001
[考研] 11408 321分求调剂 +3 huchun12138 2026-03-30 4/200 2026-04-01 22:48 by guanxin1001
[考研] 284求调剂 +12 小熊～～ 2026-03-31 12/600 2026-04-01 20:23 by 花??
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-03-31 11/550 2026-04-01 11:35 by wangjy2002
[考研] 285求调剂 +6 AZMK 2026-03-29 9/450 2026-03-30 21:02 by dophin1985
[考研] 材料专硕 085600求调剂 +7 BBQ233 2026-03-30 7/350 2026-03-30 17:44 by oooqiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭