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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关蛋白表达的问题
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zibeisha

木虫 (著名写手)

[求助] 有关蛋白表达的问题

我的目的基因片段只有200bp左右，现在连接到Pcdf-dute和pet-32a，每个都转到BL-21和Rosste中，诱导过后，sds-page检测，可是却不表达，诱导条件试过37度、25度、20度、18度和16度，IPTG浓度0.8mm、1mm和1.2mm，培养基试过LB、TB还有一个高浓度培养基，都没有表达，现在郁闷死了，无计可施了，各位大侠帮帮忙。
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
1楼 2011-11-20 20:27:24
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回帖置顶 ( 共有2个 )

凡子1985

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zibeisha(金币+3): 2011-11-21 08:41:06
wanhscn(金币+5): 热心的认真的回答！ 2011-11-21 09:01:35
西瓜(金币+2, MolEPI+1): Good！ 2011-11-22 18:09:41
蛋白原核表达本来就是个难题  你在这就寥寥几句 谁也帮不上忙 回话的都是只懂一二的 蛋白原核表达 单从表不表达上来说 主要要注意 蛋白的性质 这个是最主要的 有的蛋白是疏水性极强的 有的蛋白是毒性的 有的蛋白等等 如果相关载体 菌株 都试过了 那只能放弃这个系统了 温度 诱导浓度什么的  那只是针对表达质量而言  你现在都没表达出来 所以先确定到底有没有表达 确定载体构建是否百分百正确 然后确定蛋白真的是没表达 还是你没检测到 因为从KB数上看 你的蛋白很小 所以注意系统 可以用western检测一下  如果有表达  只是量小 那么好 再继续这个问题
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5楼2011-11-21 02:42:51
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静雨飞雪

新虫 (初入文坛)
zibeisha: 回帖置顶 2011-12-04 15:09:50
楼主，你的问题解决了没有？我的膜蛋白也只有10KD左右，做了好几个都没有结果！悲催啊！
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22楼2011-12-04 10:00:13
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普通回帖

zibeisha

木虫 (著名写手)
自己先顶一下，希望懂行的人看到帮帮忙！
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
2楼2011-11-20 21:16:06
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
zibeisha(金币+1): 这个载体没有试过。 2011-11-21 08:37:25
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-11-22 18:08:10
转速试过吗？不知道楼主实验室用过PGEX载体吗？
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jiayoubashaonian
3楼2011-11-20 21:32:12
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llglo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
zibeisha(金币+1): 2011-11-21 08:40:57
西瓜(金币-3): 广告贴 2011-11-21 20:02:03
西瓜:编辑内容 2011-11-21 20:02
------------广告贴-------------

[ Last edited by 西瓜 on 2011-11-21 at 20:02 ]
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4楼2011-11-20 23:12:00
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zibeisha

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-21 02:42:51:
蛋白原核表达本来就是个难题  你在这就寥寥几句 谁也帮不上忙 回话的都是只懂一二的 蛋白原核表达 单从表不表达上来说 主要要注意 蛋白的性质 这个是最主要的 有的蛋白是疏水性极强的 有的蛋白是毒性的 有的蛋白等 ...

目的片段是跨膜蛋白上具有免疫原性的一段，表达重组蛋白是为了制备抗体，做免疫组化和western。重组载体后单双酶切验证过，切下来的目的片段大小是对的，载体应该是成功的。
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
6楼2011-11-21 08:38:28
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xiaoshidemei

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): Good！鼓励分享经验！ 2011-11-21 11:08:39
zibeisha(金币+2): 目的片段比较小，不过加上融合蛋白的话大概有29kd了，也不算小了 2011-11-21 16:34:42
蛋白表达原因很多，温度你从25到30都试一下，一般27或者28度效果较好，IPTG一般在0.5mm左右效果比较好，最好从0.1到1.0mm都试一下，你的蛋白太小了跑胶也容易出问题，所以多摸索就知道原因了，做蛋白就是麻烦，要有耐心
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7楼2011-11-21 09:58:37
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励交流！ 2011-11-21 11:09:00
zibeisha(金币+1): 2011-11-21 16:39:45
你先确定一下你的基因确实已经转进去了，这么小的片段验证的时候很难确认的，引物引物二聚体也接近那个位置，所以你得先确认这个问题；
其次，你最好测序确认下你的基因没有发生突变什么的，氨基酸突变超过7个基本上就完全有问题了。
另外，诱导这方面一般常规条件诱导不会有什么大的差异。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
8楼2011-11-21 10:22:11
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冰泉cathy

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

zibeisha(金币+2): 不过加上融合蛋白的话有29kd。 2011-11-21 16:36:09
你的蛋白质只有200bp，sds-page不容易看到啊，就算表达了，也不一定看得到。你可以试试Tricine-SDS-PAGE 胶。
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9楼2011-11-21 12:48:10
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凡子1985

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 辛苦 2011-11-22 18:10:20
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-21 02:42:51:
蛋白原核表达本来就是个难题  你在这就寥寥几句 谁也帮不上忙 回话的都是只懂一二的 蛋白原核表达 单从表不表达上来说 主要要注意 蛋白的性质 这个是最主要的 有的蛋白是疏水性极强的 有的蛋白是毒性的 有的蛋白等 ...

好吧  得早说嘛  膜蛋白 膜蛋白表达 呵呵 看运气了  不能说太多了 http://wolfson.huji.ac.il/wolfson.html 上这学习一下 实在不行就只能另换系统了 酵母的 体外的 等等
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10楼2011-11-21 15:17:58
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