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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于蛋白重组表达的问题
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2009227004

金虫 (正式写手)

[求助] 关于蛋白重组表达的问题

最近在做一蛋白的表达，利用已有的质粒已经表达出来了带GST标签的蛋白，现在碰到了一些问题：
1、在过谷胱甘肽亲和层析柱（GS4B）分离表达蛋白时，采用了还原型谷胱甘肽（GSH）进行洗脱，然后经凝血酶酶切，再过谷胱甘肽亲和层析柱（GS4B）时，如何去掉样品里面的还原型谷胱甘肽（GSH）。
2、凝血酶的用量应如何计算，购买于sigma公司，其使用说明说也没有具体说明。
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1楼 2011-05-08 11:25:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

2009227004(金币+2): 那浓缩效果好不好，可以用buffer不断稀释浓缩？我买的是sigmaT4868 10KU的酶，这个不知道要怎么算？ 2011-05-08 21:52:19
2009227004(金币+2): 2011-05-09 10:38:49
1、透析或者上凝胶柱除去还原型谷胱甘肽。
2、凝血酶的用量如何计算问题，还是先按照不同酶用量酶切，然后根据酶切情况确定用量为好，计算的和实际使用时候总是有差距的。
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2楼2011-05-08 15:09:51
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-09 07:59:06
1、浓缩效果好不好，可以用buffer不断稀释浓缩？
两者都可以浓缩的，透析后是加高分子量的PEG处理，凝胶过滤本身就可以浓缩。你说的“可以用buffer不断稀释浓缩”不知道什么意思！
2、我买的是sigmaT4868 10KU的酶，这个不知道要怎么算？
酶的单位要看它的定义，跟底物有关的。
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3楼2011-05-08 22:30:26
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2009227004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-05-08 22:30:26:
1、浓缩效果好不好，可以用buffer不断稀释浓缩？
两者都可以浓缩的，透析后是加高分子量的PEG处理，凝胶过滤本身就可以浓缩。你说的“可以用buffer不断稀释浓缩”不知道什么意思！
2、我买的是sigmaT4868 10KU的 ...

就是不用透析，把含有GSH的样品拿去浓缩，浓到一定体积，再加入buffer再进行浓缩，重复几次，这样的效果会不会比透析差，因为我想实验连接的快一点，透析时间太久了！
单位定义是：Unit Definition: Activity is expressed in NIH units
obtained by direct comparison to a NIH Thrombin
Reference Standard, Lot K. The NIH assay procedure
uses 0.2 ml of diluted plasma (1:1 with saline) as a
substrate and 0.1 ml of albumin solution based on a
modification of the method of Biggs.18 Only clotting
times in the range of 15–25 seconds are used for
determining thrombin activity. Optimal clotting
temperature is 37 °C.
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4楼2011-05-09 10:38:12
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
2009227004(金币+16): 2 2011-05-09 11:04:14
dhd997(金币+5): good 2011-05-09 15:02:10
引用回帖:
Originally posted by 2009227004 at 2011-05-09 10:38:12:
就是不用透析，把含有GSH的样品拿去浓缩，浓到一定体积，再加入buffer再进行浓缩，重复几次，这样的效果会不会比透析差，因为我想实验连接的快一点，透析时间太久了！
单位定义是：Unit Definition: Activity ...

你这样直接浓缩的话样品和GSH都一起浓缩了，没分开。至于计算的问题，这个酶我没用过，你安装说明和文献去计算吧。我们用的是肠激酶，都是按照酶切效果来确定比例的，不是通过计算得到比例的，选择原则是尽可能发挥全部酶活性，并保证底物基本酶切。
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5楼2011-05-09 10:47:59
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2009227004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-05-09 10:47:59:
你这样直接浓缩的话样品和GSH都一起浓缩了，没分开。至于计算的问题，这个酶我没用过，你安装说明和文献去计算吧。我们用的是肠激酶，都是按照酶切效果来确定比例的，不是通过计算得到比例的，选择原则是尽可能 ...

采用适当的膜，GSH会不会因为是小分子量的而超滤出去，多次浓缩-稀释-浓缩就是想尽量去除GSH。
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6楼2011-05-09 11:04:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 很热心！ 2011-05-09 17:43:25
引用回帖:
Originally posted by 2009227004 at 2011-05-09 11:04:06:
采用适当的膜，GSH会不会因为是小分子量的而超滤出去，多次浓缩-稀释-浓缩就是想尽量去除GSH。

选择合适的超滤膜是可以的的。
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7楼2011-05-09 13:17:00
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