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2009227004

金虫 (正式写手)

[求助] 关于蛋白重组表达的问题

最近在做一蛋白的表达,利用已有的质粒已经表达出来了带GST标签的蛋白,现在碰到了一些问题:
1、在过谷胱甘肽亲和层析柱(GS4B)分离表达蛋白时,采用了还原型谷胱甘肽(GSH)进行洗脱,然后经凝血酶酶切,再过谷胱甘肽亲和层析柱(GS4B)时,如何去掉样品里面的还原型谷胱甘肽(GSH)。
2、凝血酶的用量应如何计算,购买于sigma公司,其使用说明说也没有具体说明。
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当别人都在假装正经的时候,我就假装不正经。
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

2009227004(金币+2): 那浓缩效果好不好,可以用buffer不断稀释浓缩?我买的是sigmaT4868 10KU的酶,这个不知道要怎么算? 2011-05-08 21:52:19
2009227004(金币+2): 2011-05-09 10:38:49
1、透析或者上凝胶柱除去还原型谷胱甘肽。
2、凝血酶的用量如何计算问题,还是先按照不同酶用量酶切,然后根据酶切情况确定用量为好,计算的和实际使用时候总是有差距的。
2楼2011-05-08 15:09:51
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-09 07:59:06
1、浓缩效果好不好,可以用buffer不断稀释浓缩?
两者都可以浓缩的,透析后是加高分子量的PEG处理,凝胶过滤本身就可以浓缩。你说的“可以用buffer不断稀释浓缩”不知道什么意思!
2、我买的是sigmaT4868 10KU的酶,这个不知道要怎么算?
酶的单位要看它的定义,跟底物有关的。
3楼2011-05-08 22:30:26
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2009227004

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-05-08 22:30:26:
1、浓缩效果好不好,可以用buffer不断稀释浓缩?
两者都可以浓缩的,透析后是加高分子量的PEG处理,凝胶过滤本身就可以浓缩。你说的“可以用buffer不断稀释浓缩”不知道什么意思!
2、我买的是sigmaT4868 10KU的 ...

就是不用透析,把含有GSH的样品拿去浓缩,浓到一定体积,再加入buffer再进行浓缩,重复几次,这样的效果会不会比透析差,因为我想实验连接的快一点,透析时间太久了!
单位定义是:Unit Definition: Activity is expressed in NIH units
obtained by direct comparison to a NIH Thrombin
Reference Standard, Lot K. The NIH assay procedure
uses 0.2 ml of diluted plasma (1:1 with saline) as a
substrate and 0.1 ml of albumin solution based on a
modification of the method of Biggs.18 Only clotting
times in the range of 15–25 seconds are used for
determining thrombin activity. Optimal clotting
temperature is 37 °C.
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4楼2011-05-09 10:38:12
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
2009227004(金币+16): 2 2011-05-09 11:04:14
dhd997(金币+5): good 2011-05-09 15:02:10
引用回帖:
Originally posted by 2009227004 at 2011-05-09 10:38:12:
就是不用透析,把含有GSH的样品拿去浓缩,浓到一定体积,再加入buffer再进行浓缩,重复几次,这样的效果会不会比透析差,因为我想实验连接的快一点,透析时间太久了!
单位定义是:Unit Definition: Activity ...

你这样直接浓缩的话样品和GSH都一起浓缩了,没分开。至于计算的问题,这个酶我没用过,你安装说明和文献去计算吧。我们用的是肠激酶,都是按照酶切效果来确定比例的,不是通过计算得到比例的,选择原则是尽可能发挥全部酶活性,并保证底物基本酶切。
5楼2011-05-09 10:47:59
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2009227004

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-05-09 10:47:59:
你这样直接浓缩的话样品和GSH都一起浓缩了,没分开。至于计算的问题,这个酶我没用过,你安装说明和文献去计算吧。我们用的是肠激酶,都是按照酶切效果来确定比例的,不是通过计算得到比例的,选择原则是尽可能 ...

采用适当的膜,GSH会不会因为是小分子量的而超滤出去,多次浓缩-稀释-浓缩就是想尽量去除GSH。
当别人都在假装正经的时候,我就假装不正经。
6楼2011-05-09 11:04:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 很热心! 2011-05-09 17:43:25
引用回帖:
Originally posted by 2009227004 at 2011-05-09 11:04:06:
采用适当的膜,GSH会不会因为是小分子量的而超滤出去,多次浓缩-稀释-浓缩就是想尽量去除GSH。

选择合适的超滤膜是可以的的。
7楼2011-05-09 13:17:00
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