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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白结合不到ni柱上
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paulajjh

木虫 (著名写手)

[求助] 重组蛋白结合不到ni柱上

如题，我做一种重组蛋白酶，第一次诱导表达后，蛋白很容易就结合到镍柱上了，用的国产的镍柱；但第二次，就根本结合不上，全部穿过去了，怀疑是镍柱的问题，又更换了GE的填料，还是全部穿过。
各位高手请帮忙分析一下，是什么原因造成的，为什么第一次可以，后来就结合不上了呢？
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1楼 2011-07-06 11:58:13
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
paulajjh(金币+1): 2011-07-06 16:11:30
西瓜(金币+2): 言简意赅 2011-07-06 17:04:27
重装、再生后试试。
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2楼2011-07-06 15:18:49
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！ 2011-07-06 17:04:48
paulajjh(金币+1): 柱子没有问题，没有接触过EDTA 2011-07-07 08:22:33
1、装柱质量：有无气泡、裂缝等，有的话样品会直接流出而无法充分与介质接触；
2、柱子、样品或缓冲液是否有接触过EDTA？EDTA会结合Ni，并将其从介质上带下来，通常这种问题的发生，会使Ni柱失去其本身的蓝色。
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3楼2011-07-06 16:53:00
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
dhd997(金币+2): 2011-07-06 18:49:17
装柱应该是没问题的，把填料装到空柱里，填料是保存在溶液里的，后面还用溶液来平衡，应该不会有气泡和裂缝。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-06 17:16:31
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jieyi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-07-06 21:08:17
paulajjh(金币+2): 2011-07-07 08:24:14
不知您是胞内表达、还是胞外泌表达。胞内表达破碎前以Binding buffer复溶，胞外考虑下buffer置换再上柱。也有可能是HIS标签被酶的空间构象屏蔽
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5楼2011-07-06 19:37:49
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zsy1106

金虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): 很有经验嘛 2011-07-06 21:11:06
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-06 17:16:31:
装柱应该是没问题的，把填料装到空柱里，填料是保存在溶液里的，后面还用溶液来平衡，应该不会有气泡和裂缝。

呵呵，正常情况下，一般是不会出现气泡和裂缝，但之前带师妹做实验，她出过这样的问题，柱子装的是没问题，但是过柱的时候，不小心让柱子流干了一小段，再加缓冲液进去的时候，填料和柱子之间就会有缝隙了。
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6楼2011-07-06 20:45:17
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zhcosa

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！ 2011-07-06 21:11:53
paulajjh(金币+2): 2011-07-07 08:25:53
西瓜(EPI+1): 追加 2011-07-12 23:29:41
无非就是填料、缓冲液和蛋白的问题。
1.蛋白：第一次能纯化出来，正常的话标签应该没有什么问题。
2.填料：操作没有问题的话，应该不会出现裂缝之类的，而且即便是有一点，也不会完全纯化不到蛋白。如果不放心，可以重新洗柱、再生，保证填料正常且含有足够的Ni。
3.缓冲液：首先要确定上样和洗脱缓冲液的配置是否正确，如果反了那毫无疑问是纯化不到蛋白的。如果含有破坏Ni的成分当然也不行。
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7楼2011-07-06 20:58:47
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jieyi at 2011-07-06 19:37:49:
不知您是胞内表达、还是胞外泌表达。胞内表达破碎前以Binding buffer复溶，胞外考虑下buffer置换再上柱。也有可能是HIS标签被酶的空间构象屏蔽

我胞内表达，但是没有用bingding buffer，后又透析到binding buffer,不知道这会有多大的影响。
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8楼2011-07-07 08:25:14
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhcosa at 2011-07-06 20:58:47:
无非就是填料、缓冲液和蛋白的问题。
1.蛋白：第一次能纯化出来，正常的话标签应该没有什么问题。
2.填料：操作没有问题的话，应该不会出现裂缝之类的，而且即便是有一点，也不会完全纯化不到蛋白。如果不放心， ...

分析的很全面，但是有以下疑问：
1  会不会标签在第一次中正常，以后两次异常？
2  上样缓冲液中NaCl很低或者没有，会对过柱产生怎样的影响？

另外，还有个问题，有的蛋白是不是会有只能部分结合到镍柱，而其他的直接穿过，且确认不是过载。
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9楼2011-07-07 08:28:45
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-07-06 20:45:17:
呵呵，正常情况下，一般是不会出现气泡和裂缝，但之前带师妹做实验，她出过这样的问题，柱子装的是没问题，但是过柱的时候，不小心让柱子流干了一小段，再加缓冲液进去的时候，填料和柱子之间就会有缝隙了。

呵呵，我出现过干柱的现象，但每次一出现这种情况，我就重新颠倒混匀，重新装柱，以前纯化过其他蛋白都没事情的。
不确认这个会不会这个有部分原因？
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10楼2011-07-07 08:31:02
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