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paulajjh

木虫 (著名写手)

[求助] 重组蛋白结合不到ni柱上

如题,我做一种重组蛋白酶,第一次诱导表达后,蛋白很容易就结合到镍柱上了,用的国产的镍柱;但第二次,就根本结合不上,全部穿过去了,怀疑是镍柱的问题,又更换了GE的填料,还是全部穿过。
各位高手请帮忙分析一下,是什么原因造成的,为什么第一次可以,后来就结合不上了呢?
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jieyi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-07-06 21:08:17
paulajjh(金币+2): 2011-07-07 08:24:14
不知您是胞内表达、还是胞外泌表达。胞内表达破碎前以Binding buffer复溶,胞外考虑下buffer置换再上柱。也有可能是HIS标签被酶的空间构象屏蔽
5楼2011-07-06 19:37:49
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
paulajjh(金币+1): 2011-07-06 16:11:30
西瓜(金币+2): 言简意赅 2011-07-06 17:04:27
重装、再生后试试。
2楼2011-07-06 15:18:49
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 2011-07-06 17:04:48
paulajjh(金币+1): 柱子没有问题,没有接触过EDTA 2011-07-07 08:22:33
1、装柱质量:有无气泡、裂缝等,有的话样品会直接流出而无法充分与介质接触;
2、柱子、样品或缓冲液是否有接触过EDTA?EDTA会结合Ni,并将其从介质上带下来,通常这种问题的发生,会使Ni柱失去其本身的蓝色。
3楼2011-07-06 16:53:00
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

★ ★
dhd997(金币+2): 2011-07-06 18:49:17
装柱应该是没问题的,把填料装到空柱里,填料是保存在溶液里的,后面还用溶液来平衡,应该不会有气泡和裂缝。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-06 17:16:31
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