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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白结合不到ni柱上
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paulajjh

木虫 (著名写手)

[求助] 重组蛋白结合不到ni柱上

如题，我做一种重组蛋白酶，第一次诱导表达后，蛋白很容易就结合到镍柱上了，用的国产的镍柱；但第二次，就根本结合不上，全部穿过去了，怀疑是镍柱的问题，又更换了GE的填料，还是全部穿过。
各位高手请帮忙分析一下，是什么原因造成的，为什么第一次可以，后来就结合不上了呢？
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1楼 2011-07-06 11:58:13
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
dhd997(金币+2): 2011-07-06 18:49:17
装柱应该是没问题的，把填料装到空柱里，填料是保存在溶液里的，后面还用溶液来平衡，应该不会有气泡和裂缝。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-06 17:16:31
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
paulajjh(金币+1): 2011-07-06 16:11:30
西瓜(金币+2): 言简意赅 2011-07-06 17:04:27
重装、再生后试试。
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2楼2011-07-06 15:18:49
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！ 2011-07-06 17:04:48
paulajjh(金币+1): 柱子没有问题，没有接触过EDTA 2011-07-07 08:22:33
1、装柱质量：有无气泡、裂缝等，有的话样品会直接流出而无法充分与介质接触；
2、柱子、样品或缓冲液是否有接触过EDTA？EDTA会结合Ni，并将其从介质上带下来，通常这种问题的发生，会使Ni柱失去其本身的蓝色。
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3楼2011-07-06 16:53:00
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jieyi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-07-06 21:08:17
paulajjh(金币+2): 2011-07-07 08:24:14
不知您是胞内表达、还是胞外泌表达。胞内表达破碎前以Binding buffer复溶，胞外考虑下buffer置换再上柱。也有可能是HIS标签被酶的空间构象屏蔽
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5楼2011-07-06 19:37:49
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