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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白结合不到ni柱上
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！ 2011-07-06 17:04:48
paulajjh(金币+1): 柱子没有问题，没有接触过EDTA 2011-07-07 08:22:33
1、装柱质量：有无气泡、裂缝等，有的话样品会直接流出而无法充分与介质接触；
2、柱子、样品或缓冲液是否有接触过EDTA？EDTA会结合Ni，并将其从介质上带下来，通常这种问题的发生，会使Ni柱失去其本身的蓝色。
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3楼2011-07-06 16:53:00
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zhcosa

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！ 2011-07-06 21:11:53
paulajjh(金币+2): 2011-07-07 08:25:53
西瓜(EPI+1): 追加 2011-07-12 23:29:41
无非就是填料、缓冲液和蛋白的问题。
1.蛋白：第一次能纯化出来，正常的话标签应该没有什么问题。
2.填料：操作没有问题的话，应该不会出现裂缝之类的，而且即便是有一点，也不会完全纯化不到蛋白。如果不放心，可以重新洗柱、再生，保证填料正常且含有足够的Ni。
3.缓冲液：首先要确定上样和洗脱缓冲液的配置是否正确，如果反了那毫无疑问是纯化不到蛋白的。如果含有破坏Ni的成分当然也不行。
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7楼2011-07-06 20:58:47
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 一并奖励了 2011-07-10 17:42:13
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 17:27:58:
你说的最靠近我目前的状况，我跑过电泳后发现，确实在各个梯度都有我的酶，而且酶活测定也证实了这一点。
我的柱子上新的，GE ni fast flow，按照道理来说结合效率挺高，但是就是出现流穿的现象，我怀疑是因为 ...

哦  也有可能，如果是这样的话，那肯定是结合的不牢靠，那ＬＺ换新的填料或者是按下面的步骤将Ｎｉ柱彻底重生（我们是这么重生柱子的，效果还蛮好的，希望对你有帮助：
１．３体积二次水洗涤；２．３体积１×ｓｔｒｉｐ　ｂｕｆｆｅｒ洗涤；３．２体积６Ｍ盐酸胍加０．２Ｍ乙酸溶液洗涤；４．２体积二次水；５．１体积２％ＳＤＳ；６．１体积。２５％乙醇；７．１体积５０％乙醇；８．１体积７５％乙醇；９．５体积１００％乙醇；１０．１体积７５％乙醇；１１．１体积５０％乙醇；１２．１体积２５％乙醇；１３．１体积二次水；１４．５体积１００ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；１５．３体积二次水；１６．５体积１×ｃｈａｒｇｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮｉＳＯ４）；这样处理完，保存在冰箱里，颜色应该还是很不错的。
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15楼2011-07-07 18:24:00
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