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paulajjh

木虫 (著名写手)

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[求助] 重组蛋白结合不到ni柱上

如题，我做一种重组蛋白酶，第一次诱导表达后，蛋白很容易就结合到镍柱上了，用的国产的镍柱；但第二次，就根本结合不上，全部穿过去了，怀疑是镍柱的问题，又更换了GE的填料，还是全部穿过。
各位高手请帮忙分析一下，是什么原因造成的，为什么第一次可以，后来就结合不上了呢？

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1楼 2011-07-06 11:58:13

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shuifen1108

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 一并奖励了 2011-07-10 17:42:13

引用回帖:

Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 17:27:58:
你说的最靠近我目前的状况，我跑过电泳后发现，确实在各个梯度都有我的酶，而且酶活测定也证实了这一点。
我的柱子上新的，GE ni fast flow，按照道理来说结合效率挺高，但是就是出现流穿的现象，我怀疑是因为 ...

哦也有可能，如果是这样的话，那肯定是结合的不牢靠，那ＬＺ换新的填料或者是按下面的步骤将Ｎｉ柱彻底重生（我们是这么重生柱子的，效果还蛮好的，希望对你有帮助：
１．３体积二次水洗涤；２．３体积１×ｓｔｒｉｐ　ｂｕｆｆｅｒ洗涤；３．２体积６Ｍ盐酸胍加０．２Ｍ乙酸溶液洗涤；４．２体积二次水；５．１体积２％ＳＤＳ；６．１体积。２５％乙醇；７．１体积５０％乙醇；８．１体积７５％乙醇；９．５体积１００％乙醇；１０．１体积７５％乙醇；１１．１体积５０％乙醇；１２．１体积２５％乙醇；１３．１体积二次水；１４．５体积１００ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；１５．３体积二次水；１６．５体积１×ｃｈａｒｇｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮｉＳＯ４）；这样处理完，保存在冰箱里，颜色应该还是很不错的。