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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白结合不到ni柱上
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zhcosa

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
paulajjh(金币+3): 2011-07-07 17:20:42
dhd997(金币+3): good 2011-07-10 17:41:09
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 08:28:45:
分析的很全面，但是有以下疑问：
1  会不会标签在第一次中正常，以后两次异常？
2  上样缓冲液中NaCl很低或者没有，会对过柱产生怎样的影响？

另外，还有个问题，有的蛋白是不是会有只能部分结合到镍柱， ...

1。正常的话，我觉得标签不会出什么问题，至少我们实验室做了那么多重组蛋白还没有出现国这种情况。楼主后两次诱导后电泳了么？蛋白大小有变化么？如果没变化，至少标签应该还在蛋白上吧。

2.关于NaCl在缓冲液中的作用，我查了一下镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明书，你也可以百度一下。里面明确提到，上样缓冲液中0.15～0.5M的NaCl可以消除例子交换作用。如果你的缓冲液中NaCl很低或者没有，那带来的离子交换作用可能使得你Ni丢失无法发挥作用。
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11楼2011-07-07 15:51:05
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gonghuiying

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
paulajjh(金币+1): 2011-07-07 17:20:53
dhd997(金币+2): good 2011-07-10 17:41:27
NI结合后，是否充分洗净，它也会影响蛋白也柱的结合。
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包谷
12楼2011-07-07 16:16:34
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

paulajjh(金币+3): 2011-07-07 17:23:23
我觉得LZ应该把过下来的蛋白上清，binding，Wash和最后的Elute溶液再加上蛋白Marker跑SDS-PAGE胶，看看到底哪个溶液中有你的目标蛋白，理论上一般情况下，只要标签在第一次是正常的，后面就不会有问题。你泡完胶之后，看目标蛋白有没有表达，在过柱后的哪个溶液中，这样才比较好判断是不是Ni柱填料的问题，还是过柱溶液的梯度不合适导致目标蛋白没有纯化出来。一般Ni柱还是比较禁折腾的，我觉得，我们用的Ni柱填料都三年了，而且使用频率很高，把填料完全重生之后还是可以挂住目标蛋白的，就是挂住的效率没有新柱高，所以Wash里面会有些目标蛋白
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paulajjh
13楼2011-07-07 16:27:28
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paulajjh

木虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-07-07 16:27:28:
我觉得LZ应该把过下来的蛋白上清，binding，Wash和最后的Elute溶液再加上蛋白Marker跑SDS-PAGE胶，看看到底哪个溶液中有你的目标蛋白，理论上一般情况下，只要标签在第一次是正常的，后面就不会有问题。你泡完胶之 ...

你说的最靠近我目前的状况，我跑过电泳后发现，确实在各个梯度都有我的酶，而且酶活测定也证实了这一点。
我的柱子上新的，GE ni fast flow，按照道理来说结合效率挺高，但是就是出现流穿的现象，我怀疑是因为我之前将柱子干过，对柱子产生了很大的影响，导致结合效率下降，而且可以明显观察到柱子颜色没有以前那么蓝了。
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14楼2011-07-07 17:27:58
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 一并奖励了 2011-07-10 17:42:13
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 17:27:58:
你说的最靠近我目前的状况，我跑过电泳后发现，确实在各个梯度都有我的酶，而且酶活测定也证实了这一点。
我的柱子上新的，GE ni fast flow，按照道理来说结合效率挺高，但是就是出现流穿的现象，我怀疑是因为 ...

哦  也有可能，如果是这样的话，那肯定是结合的不牢靠，那ＬＺ换新的填料或者是按下面的步骤将Ｎｉ柱彻底重生（我们是这么重生柱子的，效果还蛮好的，希望对你有帮助：
１．３体积二次水洗涤；２．３体积１×ｓｔｒｉｐ　ｂｕｆｆｅｒ洗涤；３．２体积６Ｍ盐酸胍加０．２Ｍ乙酸溶液洗涤；４．２体积二次水；５．１体积２％ＳＤＳ；６．１体积。２５％乙醇；７．１体积５０％乙醇；８．１体积７５％乙醇；９．５体积１００％乙醇；１０．１体积７５％乙醇；１１．１体积５０％乙醇；１２．１体积２５％乙醇；１３．１体积二次水；１４．５体积１００ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；１５．３体积二次水；１６．５体积１×ｃｈａｒｇｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮｉＳＯ４）；这样处理完，保存在冰箱里，颜色应该还是很不错的。
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15楼2011-07-07 18:24:00
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-10 17:42:30
paulajjh(金币+3): 2011-07-11 08:26:11
另外可以考虑是不是上样缓冲液中的咪唑浓度是不是高了。有些蛋白上柱时可以使用较高浓度的咪唑；但有些蛋白的标签伸展情况不是很好，可能就是要降低上游缓冲液中的咪唑浓度。还有一个因素是上样缓冲液的pH值是否正常。
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16楼2011-07-10 10:27:15
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paulajjh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by genegop at 2011-07-10 10:27:15:
另外可以考虑是不是上样缓冲液中的咪唑浓度是不是高了。有些蛋白上柱时可以使用较高浓度的咪唑；但有些蛋白的标签伸展情况不是很好，可能就是要降低上游缓冲液中的咪唑浓度。还有一个因素是上样缓冲液的pH值是否正 ...

你提供的细节很重要，我尝试一下。
现在bingding buffer咪唑20mM多吗？一点都没是不是也不好。
pH没有检测过，不确认样本的pH是不是会改变很多，到时候检测一下，
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17楼2011-07-11 08:28:33
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-12 23:38:47
paulajjh(金币+2): 谢谢，会尝试一下 2011-07-13 08:54:19
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-11 08:28:33:
你提供的细节很重要，我尝试一下。
现在bingding buffer咪唑20mM多吗？一点都没是不是也不好。
pH没有检测过，不确认样本的pH是不是会改变很多，到时候检测一下，

上样缓冲液中20 mM的咪唑不算多。你可以试试用10 mM和0 mM，看看是不是这个问题。
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18楼2011-07-12 22:48:13
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hinge1001

银虫 (小有名气)
换了填料还有问题，那肯定就是标签的问题了
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19楼2013-01-08 13:34:40
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灵岩苏

禁言 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
20楼2013-03-12 17:27:51
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