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zhcosa

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
paulajjh(金币+3): 2011-07-07 17:20:42
dhd997(金币+3): good 2011-07-10 17:41:09
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 08:28:45:
分析的很全面,但是有以下疑问:
1  会不会标签在第一次中正常,以后两次异常?
2  上样缓冲液中NaCl很低或者没有,会对过柱产生怎样的影响?

另外,还有个问题,有的蛋白是不是会有只能部分结合到镍柱, ...

1。正常的话,我觉得标签不会出什么问题,至少我们实验室做了那么多重组蛋白还没有出现国这种情况。楼主后两次诱导后电泳了么?蛋白大小有变化么?如果没变化,至少标签应该还在蛋白上吧。

2.关于NaCl在缓冲液中的作用,我查了一下镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明书,你也可以百度一下。里面明确提到,上样缓冲液中0.15~0.5M的NaCl可以消除例子交换作用。如果你的缓冲液中NaCl很低或者没有,那带来的离子交换作用可能使得你Ni丢失无法发挥作用。
11楼2011-07-07 15:51:05
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gonghuiying

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
paulajjh(金币+1): 2011-07-07 17:20:53
dhd997(金币+2): good 2011-07-10 17:41:27
NI结合后,是否充分洗净,它也会影响蛋白也柱的结合。
包谷
12楼2011-07-07 16:16:34
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

paulajjh(金币+3): 2011-07-07 17:23:23
我觉得LZ应该把过下来的蛋白上清,binding,Wash和最后的Elute溶液再加上蛋白Marker跑SDS-PAGE胶,看看到底哪个溶液中有你的目标蛋白,理论上一般情况下,只要标签在第一次是正常的,后面就不会有问题。你泡完胶之后,看目标蛋白有没有表达,在过柱后的哪个溶液中,这样才比较好判断是不是Ni柱填料的问题,还是过柱溶液的梯度不合适导致目标蛋白没有纯化出来。一般Ni柱还是比较禁折腾的,我觉得,我们用的Ni柱填料都三年了,而且使用频率很高,把填料完全重生之后还是可以挂住目标蛋白的,就是挂住的效率没有新柱高,所以Wash里面会有些目标蛋白

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13楼2011-07-07 16:27:28
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paulajjh

木虫 (著名写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-07-07 16:27:28:
我觉得LZ应该把过下来的蛋白上清,binding,Wash和最后的Elute溶液再加上蛋白Marker跑SDS-PAGE胶,看看到底哪个溶液中有你的目标蛋白,理论上一般情况下,只要标签在第一次是正常的,后面就不会有问题。你泡完胶之 ...

你说的最靠近我目前的状况,我跑过电泳后发现,确实在各个梯度都有我的酶,而且酶活测定也证实了这一点。
我的柱子上新的,GE ni fast flow,按照道理来说结合效率挺高,但是就是出现流穿的现象,我怀疑是因为我之前将柱子干过,对柱子产生了很大的影响,导致结合效率下降,而且可以明显观察到柱子颜色没有以前那么蓝了。
14楼2011-07-07 17:27:58
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shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 一并奖励了 2011-07-10 17:42:13
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 17:27:58:
你说的最靠近我目前的状况,我跑过电泳后发现,确实在各个梯度都有我的酶,而且酶活测定也证实了这一点。
我的柱子上新的,GE ni fast flow,按照道理来说结合效率挺高,但是就是出现流穿的现象,我怀疑是因为 ...

哦  也有可能,如果是这样的话,那肯定是结合的不牢靠,那LZ换新的填料或者是按下面的步骤将Ni柱彻底重生(我们是这么重生柱子的,效果还蛮好的,希望对你有帮助:
1.3体积二次水洗涤;2.3体积1×strip buffer洗涤;3.2体积6M盐酸胍加0.2M乙酸溶液洗涤;4.2体积二次水;5.1体积2%SDS;6.1体积。25%乙醇;7.1体积50%乙醇;8.1体积75%乙醇;9.5体积100%乙醇;10.1体积75%乙醇;11.1体积50%乙醇;12.1体积25%乙醇;13.1体积二次水;14.5体积100mMEDTA,pH8.0;15.3体积二次水;16.5体积1×charge buffer(NiSO4);这样处理完,保存在冰箱里,颜色应该还是很不错的。
15楼2011-07-07 18:24:00
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-10 17:42:30
paulajjh(金币+3): 2011-07-11 08:26:11
另外可以考虑是不是上样缓冲液中的咪唑浓度是不是高了。有些蛋白上柱时可以使用较高浓度的咪唑;但有些蛋白的标签伸展情况不是很好,可能就是要降低上游缓冲液中的咪唑浓度。还有一个因素是上样缓冲液的pH值是否正常。
16楼2011-07-10 10:27:15
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paulajjh

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by genegop at 2011-07-10 10:27:15:
另外可以考虑是不是上样缓冲液中的咪唑浓度是不是高了。有些蛋白上柱时可以使用较高浓度的咪唑;但有些蛋白的标签伸展情况不是很好,可能就是要降低上游缓冲液中的咪唑浓度。还有一个因素是上样缓冲液的pH值是否正 ...

你提供的细节很重要,我尝试一下。
现在bingding buffer咪唑20mM多吗?一点都没是不是也不好。
pH没有检测过,不确认样本的pH是不是会改变很多,到时候检测一下,
17楼2011-07-11 08:28:33
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-12 23:38:47
paulajjh(金币+2): 谢谢,会尝试一下 2011-07-13 08:54:19
引用回帖:
Originally posted by paulajjh at 2011-07-11 08:28:33:
你提供的细节很重要,我尝试一下。
现在bingding buffer咪唑20mM多吗?一点都没是不是也不好。
pH没有检测过,不确认样本的pH是不是会改变很多,到时候检测一下,

上样缓冲液中20 mM的咪唑不算多。你可以试试用10 mM和0 mM,看看是不是这个问题。
18楼2011-07-12 22:48:13
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hinge1001

银虫 (小有名气)


换了填料还有问题,那肯定就是标签的问题了
19楼2013-01-08 13:34:40
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灵岩苏

禁言 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

20楼2013-03-12 17:27:51
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