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paulajjh

木虫 (著名写手)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 2157.6
散金: 282
帖子: 1073
在线: 89.4小时
虫号: 552104
注册: 2008-04-28
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 重组蛋白结合不到ni柱上

如题，我做一种重组蛋白酶，第一次诱导表达后，蛋白很容易就结合到镍柱上了，用的国产的镍柱；但第二次，就根本结合不上，全部穿过去了，怀疑是镍柱的问题，又更换了GE的填料，还是全部穿过。
各位高手请帮忙分析一下，是什么原因造成的，为什么第一次可以，后来就结合不上了呢？

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1楼 2011-07-06 11:58:13

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

zhcosa

金虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 2 (幼儿园)
金币: 557.3
红花: 2
帖子: 87
在线: 31.1小时
虫号: 1287920
注册: 2011-05-06
专业: 水产生物免疫学与病害控制

【答案】应助回帖

★ ★ ★
paulajjh(金币+3): 2011-07-07 17:20:42
dhd997(金币+3): good 2011-07-10 17:41:09

引用回帖:

Originally posted by paulajjh at 2011-07-07 08:28:45:
分析的很全面，但是有以下疑问：
1 会不会标签在第一次中正常，以后两次异常？
2 上样缓冲液中NaCl很低或者没有，会对过柱产生怎样的影响？

另外，还有个问题，有的蛋白是不是会有只能部分结合到镍柱， ...

1。正常的话，我觉得标签不会出什么问题，至少我们实验室做了那么多重组蛋白还没有出现国这种情况。楼主后两次诱导后电泳了么？蛋白大小有变化么？如果没变化，至少标签应该还在蛋白上吧。

2.关于NaCl在缓冲液中的作用，我查了一下镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明书，你也可以百度一下。里面明确提到，上样缓冲液中0.15～0.5M的NaCl可以消除例子交换作用。如果你的缓冲液中NaCl很低或者没有，那带来的离子交换作用可能使得你Ni丢失无法发挥作用。