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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关蛋白表达的问题
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zibeisha

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-21 15:17:58:
好吧  得早说嘛  膜蛋白 膜蛋白表达 呵呵 看运气了  不能说太多了 http://wolfson.huji.ac.il/wolfson.html 上这学习一下 实在不行就只能另换系统了 酵母的 体外的 等等

呵呵，虽然是膜蛋白，不过我选取的是非跨膜区的，这样的话受膜蛋白的影响就比较小了吧？我们实验室原来做过同样的实验，也是选取膜蛋白上非跨膜区的具有免疫原性的进行表达，都没我这麻烦。
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
11楼2011-11-21 16:51:17
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牧羊犬@129
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12楼2011-11-21 16:57:51
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凡子1985

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zibeisha at 2011-11-21 16:51:17:
呵呵，虽然是膜蛋白，不过我选取的是非跨膜区的，这样的话受膜蛋白的影响就比较小了吧？我们实验室原来做过同样的实验，也是选取膜蛋白上非跨膜区的具有免疫原性的进行表达，都没我这麻烦。

其实说实话你的这个免疫原多肽很小，不知道你的page系统是真的检测到了 还是没有 标签用的是什么 建议还是用GST 纯化后 将GST切除后做抗体
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13楼2011-11-21 17:29:36
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
加cam
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
14楼2011-11-21 19:56:02
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zibeisha

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by beibei9535 at 2011-11-21 19:56:02:
加cam

cam是什么？
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
15楼2011-11-21 21:55:21
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AnkeyGO

铁虫 (初入文坛)
不知楼主的洗涤与纯化有没有问题，我们是有超声波破碎，然后做了阴阳对照，就有条带，要不楼主换一下载体？
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16楼2011-11-22 11:09:32
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zibeisha

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by AnkeyGO at 2011-11-22 11:09:32:
不知楼主的洗涤与纯化有没有问题，我们是有超声波破碎，然后做了阴阳对照，就有条带，要不楼主换一下载体？

我没有纯化，只是诱导后收集菌体，煮沸，上样，进行sds-page验证。同时我构建了两种载体pet-32a和pcdf-dute。
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
17楼2011-11-22 11:25:47
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)

大圣
6楼和1楼说的专业呀，听说表达是难事，有的人做了几年都一无所获呀！！！是这样吗？
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dasheng1980
18楼2011-11-22 20:05:03
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CrystalDo

新虫 (初入文坛)
我现在也遇到了和楼主类似的问题，我是做单链抗体-酶的表达的，我把单链抗体-酶复合物的基因与PLIP6/GN载体连接，转到BL21感受态里表达，但表达出来的复合物表达量很低，酶活性很低，抗体也没有特异性，IPTG的浓度已做过优化了，试过用PEG浓缩，浓缩后酶的活性提高了，但抗体依然没有特异性，试过超声破碎，但还是没有效果，抗体依然没有特异性，想请教一下各位，还有没什么方法可以提高复合物的表达量啊？因为表达量那么低，也不能判断抗体的活性啊。。。。。我现在这种情况还有得救吗？请各位多多指教~
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19楼2011-11-23 10:28:58
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zibeisha

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 冰泉cathy at 2011-11-21 12:48:10:
你的蛋白质只有200bp，sds-page不容易看到啊，就算表达了，也不一定看得到。你可以试试Tricine-SDS-PAGE 胶。

根据您的建议试了下Tricine-SDS-PAGE ,这个电泳是不是对PH要求很高，我们这边没有PH计，用试纸调的PH值好像不太准确，电泳过程中指示剂都没有压成一条线，并且在指示剂到胶底部是时，蛋白还在分离胶的上部，加的蛋白marker也在分离胶的上部，请问你们电泳的条件是什么？浓缩胶的电压电流，分离胶的电压电流是多少？
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
20楼2011-11-29 09:41:32
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